Luận án Nghiên cứu bào chế và đánh giá sinh khả dụng viên nang chứa Pellet verapamil giải phóng kéo dài

CHƯƠNG 2
NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, ĐỐI TƯỢNG
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên liệu
	Các nguyên liệu và hoá chất chính sử dụng trong các nội dung nghiên cứu của luận án được trình bày ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các nguyên liệu, hoá chất sử dụng trong nghiên cứu
STT
Nguyên liệu
Nguồn gốc
Tiêu chuẩn
1
Verapamil hydroclorid 
Trung Quốc
USP 38
2
Lactose
Đài Loan
USP 38
3
Avicel PH 102
Đài Loan
USP 38
4
HPMC E6, E15
Trung Quốc
USP 38
5
Aerosil® 200
Trung Quốc
USP 38
6
Natri lauryl sulfat
Đài Loan
USP 38
7
Magnesi stearat
Singapore
BP 2013
8
Talc
Trung Quốc
USP 38
9
Ethyl cellulose N10, N20
Trung Quốc
USP 38
10
Polyvinyl pyrrolidon K30
Ấn Độ
USP 38
11
TEC
Ấn Độ
USP 38
12
Dibutyl phtalat
Đức
USP 38
13
Ethanol 96%
Việt Nam
DĐVN IV
14
Natri hydroxyd
Trung Quốc
TKHH
15
Kali dihydro phosphat
Trung Quốc
TKHH
16
Acetonitril
Đức
HPLC
17
Methanol
Đức
HPLC
STT
Nguyên liệu
Nguồn gốc
Tiêu chuẩn
18
Nước cất
Việt Nam
DĐVN IV
19
Ethanol
Đức
HPLC
20
Kali hydro phosphat
Trung Quốc
TKPT
21
Acid sulfuric
Trung Quốc
TKPT
22
Vỏ nang cứng số 1
Trung Quốc
TCCS
23
Verapamil hydroclorid chuẩn. SKS QT242010914 (100,52%).
Việt Nam
TKPT 
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ
	Các thiết bị và dụng cụ chính sử dụng trong các nội dung nghiên cứu của luận án gồm có:
* Thiết bị dùng cho bào chế:
- Máy đùn tạo cầu QZT 350 (Trung Quốc). 
- Máy trộn lập phương ERWEKA (Đức).
- Máy trộn ERWEKA 2 cánh (Đức).
- Máy bao tầng sôi Mini-Glatt (Đức).
- Máy bao tầng sôi Diosna Mini-Lab (Đức).
- Máy đóng nang thủ công (Việt Nam).
- Tủ sấy Memmert ULM - 2001 (Đức).
- Cân kỹ thuật sartorius độ chính xác 0,01 g (Đức).
* Thiết bị dùng cho đánh giá tiêu chuẩn chất lượng và sinh khả dụng:
- Máy thử độ mài mòn PHARMATEST PTF E (Đức).
- Máy đo thể tích biểu kiến của hạt và bột ERWEKA SVM (Đức).
- Máy đo tốc độ chảy của hạt và bột ERWEKA GWF (Đức).
- Máy thử độ hoà tan Copley DIS 8000 (Anh).
- Máy đo quang phổ UV – VIS Labomed UVD-2960 (Mỹ).
- Cân xác định độ ẩm nhanh Sartorius MA30 (Đức).
- Máy đo pH Mettler Toledo MP 220 (Thuỵ sĩ).
- Cân phân tích Mettler toledo có độ chính xác 0,01 mg (Đức).
- Tủ vi khí hậu Binder 115 (Đức).
- Máy siêu âm Branson 5200 (Mỹ).
- Cân phân tích Mettler toledo có độ chính xác 0,01 mg (Đức).
- Cân kỹ thuật Sartorius độ chính xác 0,01 g (Đức).
- Bộ rây phân tích kích thước hạt (Trung Quốc).
- Máy khuấy từ (Anh).
- Hệ thống HPLC Alliance Waters 2695D; Detector huỳnh quang; cột (RP-C18, 250 x 4,6mm, 5µm) (Mỹ).
- Màng lọc nilon Sartorius Minisart kích thước màng 0,45µm (Đức).
- Hệ thống phễu thuỷ tinh, bộ lọc hút chân không để chuẩn bị dung môi HPLC (Sartotius, Đức).
- Bể rửa và lắc siêu âm Elma (Elmasonic S 100H, Đức).
- Máy ly tâm Scanspeed 1580 (Labogene, Đan Mạch).
- Các dụng cụ thí nghiệm khác: ống nghiệm, bình định mức, pipet, cốc có mỏ, giấy lọc đạt tiêu chuẩn phân tích và kiểm nghiệm.
2.1.3. Thuốc đối chiếu, thuốc thử 
- Thuốc đối chiếu: viên nén Vérapamil MYLAN L.P 120mg GPKD (NSX Mylan Pharmaceutical, Mỹ), số lô: Y6048, hạn dùng: 10/2019. 
- Thuốc thử: viên nang chứa pellet VER.HCl 120 mg GPKD bào chế được.
2.1.4. Động vật thí nghiệm
 	Chó ta, giống đực khoẻ mạnh, cân nặng 10 - 12 kg, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, do ban chăn nuôi động vật thí nghiệm Học viện Quân y cung cấp.
2.1.5. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
a. Địa điểm nghiên cứu: 
- Viện Đào tạo Dược, Học viện Quân y.
- Bộ môn Công nghiệp Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội.
b. Thời gian thực hiện luận án: Từ năm 2014 đến 2020.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp xây dựng công thức và quy trình bào chế viên nang verapamil hydroclorid 120 mg giải phóng kéo dài
Bào chế viên nang VER.HCl gồm 2 giai đoạn chính là: Bào chế pellet nhân và bao màng kiểm soát giải phóng DC cho pellet nhân, cụ thể: 
2.2.1.1. Phương pháp bào chế pellet verapamil hydroclorid nhân
Pellet VER.HCl được bào chế bằng phương pháp đùn - tạo cầu, với các thành phần khảo sát được trình bày như sau:
VER. HCl
:
Khảo sát tỷ lệ 30, 40 và 50 %
Avicel PH102
:
Khảo sát tỷ lệ 35, 40, 45 và 50 %
Lactose
:
Khảo sát tỷ lệ 11; 12,5 và 14 %
Talc
:
Khảo sát tỷ lệ 1; 2,5 và 4 %
HPMC E6
:
Khảo sát 0,2; 0,4; 0,6 và 0,8 g 
- Tiến hành: VER.HCl, Avicel PH102 và lactose được nghiền thành bột mịn, rây qua rây 125mm rồi trộn đều thành hỗn hợp bột kép theo nguyên tắc đồng lượng. Tá dược trơn (talc) được nghiền mịn và phân tán vào hỗn hợp bột kép. Sau đó, cho tá dược dính lỏng (dung dịch HPMC E6 trong nước) từ từ vào hỗn hợp bột kép, nhào kỹ tạo khối bột có độ dẻo thích hợp. Ủ khối dẻo trong thời gian 45 phút. Sau đó, cho vào máy đùn để tạo thành các sợi hình trụ. Các sợi hình trụ được chuyển sang máy vo tạo cầu và vo với tốc độ và thời gian phù hợp để tạo thành pellet. Sấy pellet ở nhiệt độ 40-50°C trong thời gian 12 giờ đến độ ẩm nhỏ hơn 5% rồi đem rây chọn pellet có đường kính trong khoảng 0,8 đến 1,2 mm. Pellet đạt tiêu chuẩn về kích thước được kiểm tra một số tính chất và bao màng KSGP.
- Thông số thiết bị:
Khối lượng 1 mẻ
:
100 g
Thiết bị
:
máy đùn tạo cầu QZT 350 (Trung Quốc)
Tốc độ đùn
:
30 vòng/phút
Đường kính mắt sàng
:
1 mm
Tốc độ tạo cầu
:
Khảo sát 300, 400 và 500 vòng/phút
Thời gian tạo cầu
:
Khảo sát 5, 7 và 9 phút 
- Hiệu suất bào chế pellet: H = x 100 (%).
 Trong đó:
 - m: khối lượng pellet thu được có kích thước 0,8-1,2 mm (g).
 - M: khối lượng nguyên liệu ban đầu (g).
2.2.1.2. Phương pháp bào chế pellet verapamil hydroclorid giải phóng kéo dài
Pellet VER.HCl GPKD được bào chế bằng cách bao màng KSGP DC lên pellet nhân bằng thiết bị bao tầng sôi với thành phần màng bao gồm có: polyme KSGP (EC N10, N20), tá dược tạo kênh khuếch tán (HPMC E6, E15), chất hóa dẻo (DBP, TEC), chất chống dính (talc) và dung môi (ethanol 96%). Quá trình bao KSGP được tiến hành như sau:
- Pha chế hỗn dịch bao: Ngâm và hoà tan hoàn toàn EC trong khoảng 2/3 lượng ethanol 96%; ngâm và hòa tan HPMC vào nước, sau đó phối hợp vào dung dịch EC trong ethanol 96%. Thêm chất hoá dẻo TEC vào dung dịch trên, khuấy đều đồng nhất. Nghiền bột talc, rây qua rây 125 mm, thêm ethanol 96% vào nghiền kỹ, kéo dần vào cốc chứa dịch bao. Khuấy trên máy khuấy từ khoảng 30 phút. Lọc qua rây 125 mm thu được hỗn dịch bao đồng nhất, thêm ethanol 96 % vừa đủ thể tích. Hỗn dịch được khuấy liên tục bằng máy khuấy từ trong suốt quá trình bao.
- Quá trình bao gồm các bước sau: Chuẩn bị dịch bao. Cho khoảng 20g pellet vào thiết bị bao, sấy khoảng 15 phút cho pellet nóng lên trước khi phun dịch bao. Phun dịch bao. Sau khi phun hết dịch bao cho máy hoạt động tiếp 15 phút.
- Thông số khảo sát của quá trình bao: 
	+ Tốc độ thổi khí nóng: khảo sát 12, 18 và 24 m3/giờ.
	+ Tốc độ phun dịch: khảo sát 0,45; 0,85 và 1,25 ml/phút.
	+ Áp suất phun dịch: khảo sát 1,0; 1,2 và 1,4 bar.
	+ Nhiệt độ khí vào: 55±5°C. 
	+ Nhiệt độ khí ra : 42±1°C. 
	+ Đường kính vòi phun: 1,2 mm.
- Pellet sau khi bao được sấy ở 60°C trong 6 giờ và để qua đêm để ổn định màng, sau đó đem rây để lấy pellet có đường kính từ 0,8 - 1,5 mm.
	- Hiệu suất bao phim: được tính theo công thức: 
 Hiệu suất bao phim (%) = x 100% 
	Trong đó:	+ m1: tổng khối lượng pellet sau khi bao phim (g) 	+ m2: khối lượng pellet nhân trước khi bao phim (g) 	+ m3: khối lượng chất rắn có trong công thức màng bao (g)
2.2.1.3. Phương pháp bào chế viên nang verapamil hydroclorid 120 mg giải phóng kéo dài
	Pellet sau khi bao được đóng vào nang cứng số 1 bằng máy đóng nang thủ công. Hàm lượng VER.HCl trong mỗi viên nang là 120 mg. Nang được lấp đầy bằng pellet trơ (không chứa dược chất) bào chế với các tá dược Avicel PH 102 (60 %), lactose (40 %) và tá dược dính là PVP 10 % (vđ) theo phương pháp tương tự như mô tả trong mục 2.2.1.1.
	Xác định khối lượng riêng biểu kiến của hạt pellet VER.HCl GPKD và pellet trơ theo phương pháp mô tả trong mục 2.2.2.1. Khối lượng pellet trơ được tính theo công thức như sau:
Mpellet trơ=(Vnang-).dBK pellet trơ
Trong đó:	- m: khối lượng (g)
	- V: thể tích (ml)
	- dBK: khối lượng riêng biểu kiến
2.2.2. Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và bước đầu đánh giá độ ổn định của viên nang VER.HCl giải phóng kéo dài
2.2.2.1. Phương pháp đánh giá chất lượng
a. Đánh giá tiêu chuẩn chất lượng pellet và pellet GPKD
Các chỉ tiêu đánh giá gồm có:
* Độ mài mòn: Đo bằng máy xác định độ mài mòn Pharmatest PTF 20E theo phương pháp trống quay (100 vòng trong 4 phút). Độ mài mòn được tính theo công thức: 
X = x 100%
	Trong đó: - X: độ mài mòn (%).
	 - m1: Khối lượng pellet trước khi thử (g). 
	 - m2: Khối lượng pellet sau khi thử (g).
* Xác định độ trơn chảy: Được thực hiện trên máy đo tốc độ chảy ERWEKA GWF với đường kính lỗ phễu 12 mm. Tốc độ trơn chảy được tính theo công thức: v = tgα
Trong đó:	- v: tốc độ chảy (g/giây).
	- α: góc giữa đường thẳng biểu diễn sự phụ thuộc của khối lượng hạt chảy theo thời gian và trục hoành (trục thời gian).
* Mất khối lượng do làm khô: Được xác định trên cân xác định độ ẩm nhanh Sartorius MA 30. Cân khoảng 5g pellet, nghiền mịn, đặt vào đĩa cân, đặt nhiệt độ 105°C, theo dõi và đọc kết quả.
* Khối lượng riêng biểu kiến: Xác định trên máy đo thể tích biểu kiến của hạt và bột ERWEKA SVM theo phương pháp gõ đến thể tích không đổi. Khối lượng pellet sử dụng cho mỗi lần đo là 50 g với dung tích ống đong là 50ml. Công thức tính như sau:
d=m/v
Trong đó: 	+ d: Khối lượng riêng biểu kiến. 
	+ m: Khối lượng pellet (gam).
	+ v: Thể tích biểu kiến của pellet (ml).
* Định lượng VER.HCl trong pellet:
- Mẫu thử : cân khoảng 2 g pellet, nghiền thành bột mịn. Cân chính xác lượng bột mịn tương ứng với khoảng 50 mg VER.HCl, cho vào cốc có mỏ 50ml, thêm khoảng 30ml đệm phosphat pH 7,5. Lắc siêu âm trong 60 phút. Chuyển vào bình định mức 50 ml, thêm đệm phosphat pH 7,5 tới vạch, lắc đều. Lọc qua giấy lọc, loại bỏ khoảng 10 ml dịch lọc đầu, được dung dịch A. Hút chính xác 0,5 ml dung dịch A cho vào bình định mức 10 ml, thêm đệm phosphat pH 7,5 tới vạch, lắc đều, dung dịch được đem đo quang ở bước sóng λ = 278 nm (mẫu trắng là hỗn hợp tá dược được pha với cùng điều kiện). Tiến hành song song với dung dịch chuẩn trong cùng điều kiện. Hàm lượng dược chất trong pellet được tính theo công thức:
% VER.HCl ⁄pellet= x100 (%)
	Trong đó: 	- At: Mật độ quang của dung dịch thử.
	- Ac: Mật độ quang của dung dịch chuẩn.
	- mc: Khối lượng VER.HCl chuẩn cân để định lượng (mg). 
	- mt: Khối lượng pellet cân để định lượng (mg).
	* Độ hòa tan: theo chuyên luận “Verapamil Hydrochloride Extended-Release Tablets, Test 5” USP 41 với các điều kiện cụ thể sau:
	- Thiết bị: cánh khuấy.
	- Tốc độ khuấy: 50 ± 2 vòng/phút.
	- Nhiệt độ: 37,0 ± 0,5°C.
	- Môi trường: 900 ml dung dịch đệm phosphat pH 7,5.
	- Thời gian lấy mẫu: 1, 2, 4 và 8 giờ.
	- Mẫu thử: lượng pellet tương đương với 120 mg VER.HCl
	- Định lượng DC giải phóng ở các thời điểm bằng phương pháp đo độ hấp thụ ở bước sóng 278 nm. Tính lượng GPDC căn cứ vào đường c ... c mẫu QC chứa VER.HCl chuẩn: LQC = 3 LOQ; MQC = 50 – 80% Cmax; HQC = 60 – 80% ULOQ theo bảng 2.5.
Bảng 2.5. Cách chuẩn bị các mẫu kiểm tra trong huyết tương trắng
Ký hiệu
Nồng độ (ng/ml)
Dung dịch S-W trong nước
Thể tích huyết tương trắng (ml)
Ký hiệu
Nồng độ (ng/ml)
Thể tích (ml)
LQC
60
LQC-W
600
100
900
MQC
800
MQC-W
8000
100
900
HQC
1280
HQC-W
12800
100
900
 Mẫu đường chuẩn và mẫu QC được chuẩn bị từ các dung dịch chuẩn làm việc độc lập.
Các chỉ tiêu cần phải thẩm định gồm: 
- Tính tương thích của hệ thống: Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần cùng một dung dịch chuẩn VER.HCl vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn. Độ tương thích của hệ thống HPLC được biểu thị qua hệ số biến thiên CV (%) của thời gian lưu tR, diện tích píc AUC, hệ số đối xứng T và số đĩa lý thuyết N.
- Độ đặc hiệu - chọn lọc của phương pháp: Chuẩn bị các mẫu gồm: 6 mẫu huyết tương trắng, 6 mẫu chuẩn VER.HCl trong huyết tương trắng ở nồng độ LOQ khoảng 20 ng/ml. Tiến hành xử lý mẫu và chạy sắc ký với các điều kiện đã lựa chọn. Ghi lại các sắc kí đồ và diện tích píc tại các vị trí ứng với thời gian lưu của dược chất. Quy trình phân tích phải đảm bảo có khả năng nhận diện, phân biệt được VER.HCl và không bị ảnh hưởng bởi các tạp chất có trong mẫu. Diện tích pic trên sắc ký đồ của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của VER.HCl phải không vượt quá 20% diện tích của mẫu chuẩn.
	- Đường chuẩn và khoảng tuyến tính: Pha dãy dung dịch chuẩn VER.HCl trong huyết tương trắng có nồng độ trong khoảng từ 20 - 1600 ng/ml. Tiến hành xử lý mẫu theo quy trình xây dựng rồi chạy sắc ký theo điều kiện đã chọn. Từ diện tích píc của VER.HCl thu được tại các nồng độ tương ứng, xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính giữa diện tích píc và nồng độ DC trong mẫu. Đường chuẩn phải có hệ số tương quan ≥ 0,98 và ít nhất 75% số điểm của đường chuẩn, bao gồm cả mẫu có nồng độ thấp nhất và mẫu có nồng độ cao nhất phải có độ đúng nằm trong khoảng từ 85% đến 115%, riêng điểm thấp nhất của đường chuẩn cho phép sai số không quá 20%, đồng thời 4/6 điểm QC phải nằm trên đường chuẩn.
	- Xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ): Tiến hành xử lý mẫu theo quy trình xây dựng rồi chạy sắc ký theo điều kiện đã chọn các mẫu huyết tương trắng và mẫu chuẩn VER.HCl trong huyết tương trắng có nồng độ khoảng 20 ng/ml với 6 mẫu độc lập. Ghi lại diện tích píc của mẫu trắng và mẫu chuẩn. Xác định độ đúng của phương pháp bằng cách so sánh giá trị định lượng được (tính từ đường chuẩn) với giá trị thực pha được có trong mẫu. Nồng độ được coi là giới hạn định lượng dưới của phương pháp nếu trên sắc ký đồ mẫu chuẩn ở nồng độ đó cho píc VER.HCl tách biệt với các píc tạp, có độ đúng từ 80 – 120%; độ chính xác ≤ 20% và diện tích píc VER.HCl ≥ 5 lần diện tích của mẫu trắng. 
	- Độ đúng và độ chính xác trong ngày và khác ngày: Tiến hành xử lý mẫu rồi chạy sắc ký theo điều kiện đã chọn các lô mẫu QC bao gồm LQC, MQC và HQC, mỗi lô mẫu gồm ít nhất 5 mẫu độc lập có cùng nồng độ. Ghi lại kết quả diện tích píc thu được. Xác định độ đúng trong ngày bằng cách tính tỷ lệ % giá trị tìm thấy (tính theo đường chuẩn) so với giá trị thực pha được của các mẫu trong cùng 1 ngày. Độ đúng của phương pháp tại mỗi nồng độ phải nằm trong khoảng từ 85% đến 115%. Độ chính xác trong ngày thể hiện qua hệ số biến thiên (CV%) giữa giá trị các lần định lượng của mỗi nồng độ được phân tích trong cùng một ngày. Yêu cầu giá trị CV phải ≤ 15%. Độ đúng và độ chính xác khác ngày: Tiến hành tương tự như xác định độ đúng và độ chính xác trong ngày. Tính giá trị tỷ lệ tìm thấy và CV của kết quả định lượng cho mỗi nồng độ trong ít nhất 3 ngày phân tích khác nhau. Giá trị CV phải ≤ 15%, độ đúng nằm trong khoảng 85 – 115%. 
	- Hiệu suất chiết: Tiến hành trên các mẫu LQC, MQC, HQC và mẫu chuẩn có nồng độ tương ứng pha trong huyết tương trắng đã xử lý (mẫu nền hay mẫu spike). Xử lý các mẫu chuẩn QC theo phương pháp đã xây dựng. Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn, xác định nồng độ VER.HCl có trong các mẫu QC và mẫu spike. Xác định tỷ lệ thu hồi bằng cách so sánh kết quả lượng VER.HCl của mẫu thử có qua chiết tách – với mẫu spike. Tỷ lệ thu hồi (H%) VER.HCl được xác định bằng công thức: 
Trong đó:
- ST: Diện tích píc của VER.HCl có trong mẫu đã qua chiết tách. 
- Sc: Diện tích píc VER.HCl của mẫu spike.
- n: Hệ số pha loãng của mẫu xử lý qua chiết tách.
Kỹ thuật chiết tách, xử lý mẫu là thích hợp khi tỷ lệ thu hồi không quá 110% và không thấp hơn 30%; CV (%) của giá trị tỷ lệ thu hồi tại các nồng độ không quá 15% và tỷ lệ thu hồi trung bình tại các nồng độ khác nhau không quá ± 15 %.
	- Độ ổn định:
	Xác định độ ổn định của VER.HCl trong huyết tương sau ba chu kỳ đông – rã đông; trong quá trình xử lý mẫu và trong quá trình bảo quản dài ngày và sau xử lý mẫu trên các mẫu LQC và HQC. Ở mỗi nồng độ, tiến hành xử lý tối thiểu 5 mẫu. Tính nồng độ của các mẫu dựa vào đường chuẩn.
	Độ ổn định sau ba chu kỳ đông – rã đông: Khảo sát độ ổn định sau ba chu kỳ đông - rã thực hiện trên 2 nồng độ LQC và HQC. Bảo quản mẫu ở nhiệt độ -400C và để rã đông ở nhiệt độ phòng. Sau khi đã tan chảy hoàn toàn, để mẫu trở lại đông lạnh trong 12 – 24 giờ. Sau 3 chu kỳ đông – rã, tiến hành phân tích xác định nồng độ VER.HCl có trong mẫu. So sánh với kết quả xác định nồng độ VER.HCl có trong các mẫu tiến hành phân tích ngay sau khi pha (nồng độ ban đầu). Kết quả xác định nồng độ VER.HCl có trong mẫu sau 3 chu kỳ đông – rã đông phải tương đương với lượng VER.HCl có trong mẫu phân tích ngay sau khi để rã đông.
	Độ ổn định ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn: So sánh lượng VER.HCl có trong mẫu được chiết tách ngay sau khi rã đông và mẫu có nồng độ tương ứng chỉ được chiết tách sau khi đã rã đông và để ở nhiệt độ phòng 6 giờ. Kết quả phải sai khác không có ý nghĩa thống kê.
	Độ ổn định dài ngày: Bảo quản mẫu trong điều kiện –40oC. Phân tích xác định nồng độ VER.HCl trong các mẫu sau từng khoảng thời gian, ban đầu và sau 14 đến 29 ngày. So sánh kết quả định lượng của các mẫu tại từng thời điểm trong quá trình theo dõi với giá trị định lượng ban đầu. Mẫu phải ổn định tại điều kiện bảo quản trong khoảng thời gian tối thiểu phải đủ để tiến hành lấy mẫu máu và phân tích hết số mẫu huyết tương sẽ lấy (khoảng 4 tuần).
	Độ ổn định của mẫu sau xử lý: Tiến hành chuẩn bị mẫu huyết tương ở nồng độ LQC và HQC, rồi xử lý mẫu theo quy trình đã xây dựng. Số mẫu sau xử lý được chia làm 2 phần: Phần 1 tiêm sắc ký ngay sau khi xử lý; phần 2 để trong auto - sampler chờ 12 giờ sau xử lý rồi tiêm sắc ký. So sánh nồng độ VER.HCl của mẫu tiêm sắc ký ngay và mẫu tiêm sắc ký 12 giờ sau xử lý.
2.2.3.2. Đánh giá sinh khả dụng trên chó
a. Thiết kế nghiên cứu - bố trí thí nghiệm
- Bố trí thí nghiệm: theo phương pháp chéo đôi, ngẫu nhiên, đơn liều, 2 giai đoạn, bố trí 2 đợt cách nhau 7 - 10 ngày. Thực hiện trên 6 cá thể chó đực, khỏe mạnh được chia ngẫu nhiên thành 2 nhóm, mỗi nhóm 3 con. Thiết kế giai đoạn thử được thể hiện ở bảng 2.6.
Bảng 2.6: Bố trí thử theo phương pháp chéo đôi
Động vật thí nghiệm
Giai đoạn 1
Giai đoạn 2
Nhóm 1
Thuốc thử T
Thuốc đối chiếu R
Nhóm 2
Thuốc đối chiếu R
Thuốc thử T
- Chọn cá thể chó đực khỏe mạnh, cân nặng 10 - 12 kg/con, được theo dõi trước khi tiến hành thí nghiệm 1 tuần. Bữa tối trước ngày dùng thuốc, cho chó ăn nhẹ trước 10 giờ đêm. Ngày dùng thuốc, không cho chó ăn sáng, cho chó uống 1 viên thuốc còn nguyên vẹn với 50 ml nước (trong tình trạng không gây mê) và cho chó ăn vào thời điểm 8 giờ kể từ sau khi uống thuốc.
b. Lấy và bảo quản mẫu huyết tương
- Lấy mẫu máu: Dùng kim vô khuẩn lấy máu tĩnh mạch cẳng chân sau của chó, mỗi lần lấy khoảng 3ml máu. Lấy máu chó cho vào các ống ly tâm sạch đã đánh số có chứa chất chống đông. Mẫu máu được lấy ngay trước khi cho chó uống thuốc (0 giờ) và sau khi uống thuốc vào các khoảng thời gian 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 12, 16 và 24 giờ sau khi uống. Sau mỗi lần lấy máu cho chó uống khoảng 10ml nước hoặc dung dịch glucose 5%.
- Bảo quản huyết tương: Sau khi lấy máu, mẫu máu được ly tâm tách huyết tương với tốc độ 5000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Huyết tương được bảo quản lạnh -40°C cho đến khi tiến hành phân tích. Thời gian bảo quản huyết tương không quá 29 ngày. Thời gian giữa 2 đợt thử thuốc cách nhau 7 ngày. 
 c. Xác định các thông số dược động học và đánh giá kết quả
	Định lượng VER.HCl trong các mẫu huyết tương chó sau khi uống thuốc bằng phương pháp phân tích đã được thẩm định. Phân tích mẫu được bắt đầu ngay sau khi lấy đủ các mẫu. Toàn bộ lượng mẫu (mẫu thuốc thử/thuốc chứng) được phân tích trong cùng một ngày. Quá trình phân tích tuân thủ theo hướng dẫn về phân tích mẫu trong dịch sinh học (bioanalytical runs) của USA – FDA. Từ nồng độ thuốc đã định lượng được trong các mẫu huyết tương, vẽ đường cong nồng độ thuốc – thời gian của từng cá thể. Xác định các thông số dược động học (DĐH) của thuốc thử và thuốc chứng:
- Cmax và Tmax: Xác định từ các số liệu thực nghiệm.
- AUC0-t: Xác định bằng phương pháp hình thang:
[AUC]0t=
- Ci: Là nồng độ VER.HCl tại thời điểm lấy mẫu tại ti.
- AUCo-∞=AUC0-t+Cn/λz.
Trong đó:
 + Cn :	Nồng độ VER.HCl tại thời điểm lấy mẫu cuối cùng.
 + λz : 	Hệ số thải trừ.
- AUMC: 	Diện tích dưới đường cong x thời gian - thời gian
=
- MRT: Thời gian lưu trú trung bình của phân tử thuốc
MRT=
- Xác định SKD: Đánh giá SKD giữa viên nang VER.HCl 120 mg GPKD với viên đối chứng bằng cách so sánh các thông số: , Cmax, MRT, Tmax theo quy định của USP 41 [3]; cụ thể như sau:
	+ Với , Cmax, MRT: Sử dụng ‘‘khoảng tin cậy 90%’’ còn gọi là phương pháp Two-one-sided t-test. Các thông số cần so sánh (, Cmax, MRT) của thuốc thử và chế phẩm đối chiếu thu được từ thiết kế chéo đôi, đơn liều chuyển qua dạng logarit tự nhiên và đưa vào phân tích phương sai. Khoảng tin cậy 90% CI được tính theo công thức:
CI=µT - µR ± t(0,1 ;n).(S.2/N)1/2
Với : - µT : Giá trị trung bình thu từ mẫu thử chuyển sang logarit.
 - µR : Giá trị trung bình thu từ mẫu đối chiếu chuyển sang logarit.
 - t(0,1; n): Kết quả tra bảng Student t-test với bậc tự do n với mức ý nghĩa 0,1.
 - S : Căn bậc hai của bình phương sai số trung bình thu được từ kết quả phân tích phương sai của thiết kế chéo đôi đơn liều.
 - N : Tổng số động vật thí nghiệm.
+ Tmax : So sánh theo phương pháp thống kê phi tham số (Wincoxon signed rank test).
	Hai chế phẩm được coi là TĐSH nếu CI nằm trong khoảng (0,8 - 1,25) và Tmax khác nhau không có ý nghĩa thống kê.
	Xác định các thông số dược động học: Tmax, t1/2 , Cmax , Kel,... theo phương pháp không dựa trên mô hình ngăn bằng phần mềm Kinetica 4.4.
2.2.4. Công cụ tính toán số liệu, thiết kế thí nghiệm và tối ưu hoá
- Bố trí thí nghiệm: Theo mô hình mặt hợp tử tại tâm sử dụng phần mềm Modde 8.0.
- Tối ưu hoá: Bằng phần mềm Inform 3.1. 
- Tính toán các thông số dược động học: Bằng phần mềm Kinetica 4.4.
- Các số liệu thống kê: Bằng phần mềm Excel 2010.
	Các kết quả được xử lý và biểu thị trong luận án dưới dạng: Giá trị trung bình ( X ), độ lệch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tương đối (RSD %).