Luận án Nghiên cứu tác dụng theo hướng điều trị Alzheimer trên thực nghiệm của Đan sâm di thực (Salvia miltiorrhiza Bunge, Lamiaceae)
Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về bệnh Alzheimer
1.1.1. Khái niệm
Bệnh Alzheimer được mô tả lần đầu tiên vào năm 1906 bởi một bác sỹ người
Đức là Alois Alzheimer. Tuy nhiên phải đến năm 1984, một khái niệm tương đối
hoàn chỉnh về bệnh Alzheimer mới được đưa ra dưới sự đồng thuận của Viện quốc
gia về đột quỵ và các rối loạn thần kinh, giao tiếp và Hiệp hội bệnh Alzheimer và
các rối loạn liên quan. Trong đó, Alzheimer là một bệnh rối loạn về não đặc trưng
bởi trạng thái mất trí nhớ tiến triển xảy ra ở giai đoạn giữa và cuối đời. Các đặc
điểm của bệnh bao gồm thoái hóa một số tế bào thần kinh, xuất hiện các mảng β-
amyloid ngoại bào và đám rối nội thần kinh; rối loạn cơ chế truyền tin trong hệ
cholinergic ở não trước, đôi khi ảnh hưởng đến cả hệ noradrenegic và
somatostatinergic [144].
1.1.2. Dịch tễ
Bệnh Alzheimer là dạng phổ biến nhất của hội chứng sa sút trí tuệ và số
lượng bệnh nhân có xu hướng gia tăng do tuổi thọ trung bình ngày càng cao, ước
tính tăng gấp ba lần vào năm 2050 [15]. Số lượng người mắc bệnh Alzheimer chiếm
60-80% trong 50 triệu ca mắc sa sút trí tuệ trên toàn thế giới [16], [20]. Bệnh gặp
chủ yếu ở người cao tuổi. Tỷ lệ mắc bệnh chiếm khoảng 4% dân số trên 60 tuổi và
20-40% dân số trên 85 tuổi [83], [89]. Tỷ lệ mắc mới tăng 5-7 triệu người mỗi năm
[182]. Tỷ lệ mắc bệnh ở nữ nhiều hơn nam [16]. Thời gian sống trung bình sau khi
khởi phát sa sút trí tuệ dao động từ 3,3 đến 11,7 năm [79].
Ở Mỹ, số người trên 65 tuổi mắc bệnh Alzheimer là 5,8 triệu, chiếm 10%
dân số trên 65 tuổi. Ước tính đến năm 2050 số lượng bệnh nhân sẽ tăng lên 13,8
triệu. Đây là một trong 6 nguyên nhân tử vong hàng đầu tại Mỹ với 122.000 người
chết vào năm 2018 [20], [21], [51]. Ở Châu Âu, tỷ lệ hiện mắc Alzheimer chiếm
5,1% dân số [243]. Ở Châu Phi, tỷ lệ hiện mắc là 57,1% dân số trên 50 tuổi. Với
khu vực Châu Á, tỷ lệ hiện mắc ở Hàn Quốc là 4,8% dân số trên 65 tuổi; tại Trung
Quốc là 1,9% dân số trên 60 tuổi. Đáng chú ý là tỷ lệ mắc bệnh ở các nước đang
phát triển cao hơn các nước phát triển [181].4
Tại Việt Nam, chưa có báo cáo mang tính đại diện cho thực trạng bệnh
Alzheimer trong cả nước. Tuy nhiên, một số nghiên cứu dịch tễ đã tiến hành đánh
giá tỷ lệ mắc sa sút trí tuệ ở một số tỉnh và ghi nhận ở Ba Vì, thành phố Hà Nội, tỷ lệ
người trên 60 tuổi bị sa sút trí tuệ chiếm 4,5% dân số vào năm 2010 [7]; ở Đống Đa
và Sóc Sơn, thành phố Hà Nội chiếm 4,2% dân số vào năm 2014 [9].
1.1.3. Triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng
1.1.3.1. Triệu chứng lâm sàng
Triệu chứng lâm sàng của bệnh Alzheimer biểu hiện qua các rối loạn liên
quan đến nhận thức và không liên quan đến nhận thức. Một số triệu chứng liên quan
đến nhận thức như suy giảm trí nhớ, suy giảm sử dụng động tác, suy giảm thị giác
không gian, suy giảm ngôn ngữ và suy giảm chức năng điều hành. Trong số đó, suy
giảm trí nhớ là dấu hiệu lâm sàng điển hình nhất, thường xuất hiện sớm và mức độ
tăng dần theo thời gian.
Alzheimer là bệnh thoái hóa thần kinh tiến triển trải qua ba giai đoạn gồm
tiền lâm sàng, suy giảm nhận thức nhẹ và sa sút trí tuệ [42], [195]. Trong giai đoạn
tiền lâm sàng, người bệnh có thể xuất hiện một số biểu hiện của rối loạn nhận thức
như giảm trí nhớ ngắn hạn và ngôn ngữ. Giai đoạn suy giảm nhận thức nhẹ, người
bệnh thường có biểu hiện giảm cả trí nhớ ngắn hạn và dài hạn kèm theo giảm chức
năng điều hành, ngôn ngữ và thị giác không gian. Giai đoạn sa sút trí tuệ tiến triển
theo ba mức độ: nhẹ, trung bình và nặng. Trong giai đoạn sa sút trí tuệ mức độ
nặng, người bệnh có biểu hiện mất trí nhớ kèm theo suy giảm nặng nề hoặc mất
chức năng điều hành, sử dụng động tác, ngôn ngữ và thị giác không gian nên phải
phụ thuộc hoàn toàn vào người chăm sóc [14], [145], [195].
Ngoài ra, bệnh Alzheimer cũng biểu hiện qua triệu chứng không liên quan
đến nhận thức bao gồm rối loạn hành vi, tâm thần và cảm xúc như thờ ơ, kích động,
gây hấn, không hợp tác, đi lang thang; hoang tưởng, ảo giác, co giật, động kinh;
thay đổi tính khí, lo âu, rối loạn giấc ngủ và trầm cảm [42], [195]. Trong giai đoạn
tiền lâm sàng, người bệnh chưa có biểu hiện rối loạn hành vi, tâm thần hay cảm xúc.
Những rối loạn này bắt đầu xuất hiện ở giai đoạn suy giảm nhận thức nhẹ và trở nên
trầm trọng ở giai đoạn sút trí tuệ mức độ nặng [14], [15], [51], [80], [145], [195]
Tóm tắt nội dung tài liệu: Luận án Nghiên cứu tác dụng theo hướng điều trị Alzheimer trên thực nghiệm của Đan sâm di thực (Salvia miltiorrhiza Bunge, Lamiaceae)
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ LOAN NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG THEO HƯỚNG ĐIỀU TRỊ ALZHEIMER TRÊN THỰC NGHIỆM CỦA ĐAN SÂM DI THỰC (Salvia miltiorrhiza Bunge, Lamiaceae) LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ LOAN NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG THEO HƯỚNG ĐIỀU TRỊ ALZHEIMER TRÊN THỰC NGHIỆM CỦA ĐAN SÂM DI THỰC (Salvia miltiorrhiza Bunge, Lamiaceae) LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH DƯỢC LÝ - DƯỢC LÂM SÀNG MÃ SỐ : 62720405 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Đào Thị Vui PGS.TS. Nguyễn Thành Hải HÀ NỘI, NĂM 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi thực hiện. Các số liệu và kết quả nêu trong luận án là trung thực, chưa từng được công bố bởi bất kỳ tác giả hoặc ở bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận án Trần Thị Loan LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ phía các thầy cô, đồng nghiệp, gia đình và bạn bè. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới: PGS.TS. Đào Thị Vui – Trưởng bộ môn Dược lực, Trường Đại học Dược Hà Nội và PGS.TS. Nguyễn Thành Hải – Giảng viên bộ môn Dược lâm sàng, Trường Đại học Dược Hà Nội, là những người Thầy đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình dìu dắt, chỉ bảo, trang bị cho tôi những kiến thức khoa học quý giá và luôn động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Ban giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội, Bộ môn Dược lực, Bộ môn Dược lâm sàng, Bộ môn Dược liệu, Phòng Quản lý Đào tạo Sau đại học - Trường Đại học Dược Hà Nội đã quan tâm tạo điều kiện, cho tôi được học tập và nghiên cứu. Ban Giám đốc Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên, Khoa Dược và các Phòng chức năng - Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên đã luôn động viên tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. PGS.TS. Phương Thiện Thương cùng khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu; PGS.TS. Phạm Thị Nguyệt Hằng cùng khoa Dược lý – Sinh hóa, Viện Dược liệu ; PGS.TS. Bùi Thanh Tùng và ThS. Đặng Kim Thu – Đại học Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội; ThS. Trần Danh Việt – Trung tâm nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian hoàn thành luận án. DS. Ngô Thị Dịu – sinh viên khóa 68 và DS. Nguyễn Thị Thanh – sinh viên khóa 69 đã đồng hành cùng tôi trong thời gian nghiên cứu. Cuối cùng, cho phép tôi bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè thân thiết đã luôn ở bên động viên và là chỗ dựa tinh thần để tôi vượt qua những khó khăn vất vả trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Trần Thị Loan MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ................................................... i DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU .......................................................................... iii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ .................................................................. v ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1 Chương 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 3 1.1. Tổng quan về bệnh Alzheimer ............................................................................ 3 1.1.1. Khái niệm .......................................................................................................... 3 1.1.2. Dịch tễ ............................................................................................................... 3 1.1.3. Triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng ............................................................. 4 1.1.4. Cơ chế bệnh sinh và các đích liên quan đến cơ chế bệnh sinh ......................... 5 1.2. Tổng quan về thuốc điều trị bệnh Alzheimer và hợp chất đang nghiên cứu . 13 1.2.1. Tổng quan về thuốc điều trị bệnh Alzheimer .................................................. 13 1.2.2. Tổng quan về các hợp chất đang nghiên cứu trong điều trị bệnh Alzheimer . 15 1.3. Tổng quan một số mô hình gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm và phương pháp đánh giá trong nghiên cứu thuốc điều trị Alzheimer .................................... 17 1.3.1. Các mô hình gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm ............................................. 17 1.3.2. Phương pháp đánh giá tác dụng thông qua các test hành vi ........................... 22 1.3.3. Phương pháp đánh giá tác dụng trên một số đích liên quan đến cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer ........................................................................................... 25 1.4. Tổng quan về Đan sâm ..................................................................................... 28 1.4.1. Tên khoa học ................................................................................................... 28 1.4.2. Đặc điểm thực vật và phân bố ......................................................................... 28 1.4.3. Bộ phận dùng .................................................................................................. 29 1.4.4. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của rễ Đan sâm ................................. 29 1.4.5. Các nghiên cứu về tác dụng dược lý liên quan đến điều trị bệnh Alzheimer trên thực nghiệm của Đan sâm .................................................................................. 29 Chương 2. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................................. 33 2.1. Nguyên liệu nghiên cứu .................................................................................... 33 2.1.1. Dược liệu nghiên cứu ...................................................................................... 33 2.1.2. Chuẩn bị các mẫu nghiên cứu ......................................................................... 34 2.1.3. Động vật nghiên cứu ....................................................................................... 36 2.1.4. Tế bào nghiên cứu ........................................................................................... 36 2.2. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị nghiên cứu ............................................................ 36 2.2.1. Hóa chất nghiên cứu ........................................................................................ 36 2.2.2. Máy móc và thiết bị nghiên cứu ...................................................................... 37 2.3. Địa điểm nghiên cứu ......................................................................................... 38 2.4. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 38 2.5. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 40 2.5.1. Phương pháp nghiên cứu tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên mô hình gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm thông qua một số test hành vi ............................ 40 2.5.2. Phương pháp đánh giá tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên một số đích liên quan đến cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer ................................................ 48 2.6. Xử lý số liệu ....................................................................................................... 58 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................. 59 3.1. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên mô hình gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm thông qua các test hành vi .......................................................................... 59 3.1.1. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamin ................................................................................................................ 59 3.1.2. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng β-amyloid25-35 ............................................................................................................ 65 3.1.3. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng trimethyltin ................................................................................................................ 68 3.2. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên một số đích liên quan đến cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer ................................................................................ 72 3.2.1. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực liên quan đến giả thuyết cholinergic ... 72 3.2.2. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực liên quan đến giả thuyết β-amyloid .... 78 3.2.3. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực liên quan đến giả thuyết stress oxy hóa ................................................................................................................................... 81 Chương 4. BÀN LUẬN ........................................................................................... 87 4.1. Đối tượng nghiên cứu và liều dùng của cao rễ Đan sâm trong nghiên cứu . 87 4.1.1. Dược liệu nghiên cứu ...................................................................................... 87 4.1.2. Chiết xuất mẫu nghiên cứu ............................................................................. 88 4.1.3. Liều dùng của cao rễ Đan sâm trong nghiên cứu ............................................ 89 4.2. Tác dụng của cao rễ Đan sâm trên mô hình gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm thông qua các test hành vi .......................................................................... 90 4.2.1. Các test hành vi sử dụng trong nghiên cứu ..................................................... 90 4.2.2. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamin ................................................................................................................ 93 4.2.3. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng β-amyloid25-35 ............................................................................................................ 97 4.2.4. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng trimethyltin .............................................................................................................. 102 4.3. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên một số đích liên quan đến cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer .............................................................................. 105 4.3.1. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực trên đích liên quan đến giả thuyết cholinergic ............................................................................................................... 105 4.3.2. Tác dụng của cao rễ Đan sâm di thực liên quan đến giả thuyết β-amyloid .. 110 4.3.3. Tác dụng của cao rễ Đan ... in tiêm phúc mạc đến chuột nhắt trắng Lô (n=6) Liều trimethyltin (mg/kg) Số lượng chuột co giật (con) Số lượng chuột chết (con) Tỷ lệ chuột chết và co giật (%) Chứng sinh lý 0 0 0 TMT1 2,3 1 0 16,7 TMT2 2,4 1 1 33,3 TMT3 2,5 1 2 50,0 Kết quả bảng 9.1 cho thấy lô bệnh TMT1 được tiêm phúc mạc trimethyltin liều 2,3 mg/kg không gây chết chuột mà chỉ làm co giật 01 con. Trong khi đó hai lô bệnh TMT2 và TMT3 ở mức liều cao hơn đều gây chết chuột. Dựa vào kết quả trên trimethyltin tiêm phúc mạc liều 2,3 mg/kg được lựa chọn cho thử nghiệm đánh giả khả năng gây suy giảm trí nhớ. 9.4.2. Kết quả về khả năng gây suy giảm trí nhớ của trimethyltin trên chuột nhắt 9.4.2.1. Ảnh hưởng của trimethyltin trong test mê lộ chữ Y Trong test mê lộ chữ Y, ảnh hưởng của trimethyltin tiêm phúc mạc liều 2,3 mg/kg được đánh giá thông qua tỷ lệ chuyển tiếp và tổng số lần vào cánh tay. Kết quả được trình bày trong bảng 9.2. Bảng 9.2. Ảnh hưởng của trimethyltin trong test mê lộ chữ Y Lô Tỷ lệ chuyển tiếp (%) Tổng số lần vào cánh tay Sinh lý 2D 70,49 ± 4,03 38,83 ± 5,91 TMT 2D 56,27 ± 10,60* 41,50 ± 12,55 % giảm so với sinh lý 20,17 Sinh lý 7D 67,85 ± 4,08 35,50 ± 7,50 TMT 7D 62,38 ± 4,76 36,50 ± 5,28 % giảm so với sinh lý 8,06 xxxiv Kết quả bảng 9.2 cho thấy, lô chứng bệnh TMT 2D được đánh giá test mê lộ chữ Y 2 ngày sau khi tiêm trimethyltin có tỷ lệ chuyển tiếp giảm 20,17% so với lô chứng sinh lý (p<0,05). Tuy nhiên lô bệnh TMT 7D được đánh giá test mê lộ chữ Y 7 ngày sau khi tiêm trimethyltin có tỷ lệ chuyển tiếp giảm không có ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý (p>0,05) 9.4.2.2. Ảnh hưởng của trimethyltin trong test mê lộ nước Morris Trong test mê lộ nước Morris, ảnh hưởng của trimethyltin được đánh giá thông qua thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ và thời gian chuột lưu lại ở góc phần tư đích. - Ảnh hưởng của trimethyltin đến thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ Trong bài tập có bến đỗ của test mê lộ nước Morris, ảnh hưởng của trimethyltin đến thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ được trình bày trong bảng 9.3. Bảng 9.3. Ảnh hưởng của trimethyltin đến thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ trong test mê lộ nước Morris Lô (n=8) Thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ (giây) Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Sinh lý 2D 79,15 ± 12,52 46,40 ± 25,43* 38,13 ± 24,79** 28,97 ± 13,38*** % giảm so với ngày 1 41,38 51,83 63,40 TMT 2D 73,23 ± 13,96 72,78 ± 18,37 58,37 ± 14,92 62,38 ± 26,57 % giảm so với ngày 1 0,61 20,29 14,82 Sinh lý 7D 71,33 ± 15,71 42,67 ± 17,70* 40,18 ± 18,58** 27,37 ± 22,07** % giảm so với ngày 1 40,18 43,67 61,63 TMT 7D 70,63 ± 13,96 47,24 ± 14,02* 39,47 ± 14,02** 62,92 ± 11,97 % giảm so với ngày 1 33,12 44,12 10,92 Kết quả bảng 9.3 cho thấy, trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng trimethyltin, thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ của lô chứng sinh lý 2D và lô xxxv chứng sinh lý 7D ở ngày 2, 3 và 4 giảm có ý nghĩa thống kê so với ngày 1. Trong khi đó, lô bệnh TMT 2D có thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ ở ngày 2, 3 và 4 không có sự khác biệt so với ngày 1 (p>0,05). Lô chứng bệnh TMT 7D có thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ ở ngày 2 và 3 giảm khác biệt so với ngày 1. - Ảnh hưởng của trimethyltin đến thời gian chuột lưu lại ở góc phần tư đích Trong bài tập không có bến đỗ của test mê lộ nước Morris, ảnh hưởng của trimethyltin được đánh giá thông qua thời gian chuột lưu lại ở góc phần tư đích. Kết quả được trình bày trong bảng 9.4 Bảng 9.4. Ảnh hưởng của trimethyltin đến thời gian chuột ở góc phần tư đích trong test mê lộ nước Morris Lô (n=8) Thời gian ở góc phần tư đích (giây) Tỷ lệ giảm so với lô chứng sinh lý (%) Sinh lý 2D 32,19 ± 6,22 TMT 2D 20,20 ± 3,08** 37,25 Sinh lý 7D 25,52 ± 2,16 TMT 7D 21,61 ± 2,88* 15,32 Kết quả bảng 9.4 cho thấy, lô chứng bệnh TMT 2D được đánh giá test mê lộ nước Morris 5 ngày sau khi tiêm trimethyltin có thời gian chuột ở góc phần tư đích giảm 37,25% so với lô chứng sinh lý 2D (p<0,01). Lô chứng bệnh TMT 7D được đánh giá test mê lộ nước Morris 10 ngày có thời gian chuột ở góc phần tư đích giảm 15,32% so với lô chứng sinh lý 7D (p<0,05). xxxvi PHỤ LỤC 10 DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM TRONG CÁC TEST HÀNH VI 10.1. Test mê lộ chữ Y Dụng cụ thí nghiệm là một hộp gỗ hình chữ Y gồm ba cánh tay giống nhau (kích thước 30 × 6 × 15 cm) được đặt đối xứng sao cho góc giữa hai cánh tay bất kì bằng 120o. Dụng cụ được minh họa trong hình 10.1. Hình 10.1. Dụng cụ thí nghiệm trong test mê lộ chữ Y 10.2. Test né tránh thụ động Dụng cụ thí nghiệm là hình hộp chữ nhật bao gồm 2 buồng là buồng sáng và buồng tối có kích thước giống nhau (20 × 20 × 20 cm), được ngăn cách bởi một cửa có khả năng đóng mở tự động. Buồng sáng được chiếu sáng bằng một bóng đèn 50W; buồng tối không được chiếu sáng. Sàn của buồng tối có các thanh thép nối với máy tạo dòng điện có cường độ tùy chỉnh. Dụng cụ được minh họa trong hình 10.2. Hình 10.2. Dụng cụ thí nghiệm trong test né tránh thụ động xxxvii 10.3. Test nhận diện đồ vật Dụng cụ thí nghiệm gồm 1 hộp hình trụ kích thước 50 x 50 x 50 cm. Các đồ vật bao gồm O1, O2 giống hệt nhau và O3 có hình dạng và kích thước khác O1, O2. Dụng cụ được minh họa trong hình 10.3. Hình 10.3. Dụng cụ thí nghiệm trong test nhận diện đồ vật 10.4. Test mê lộ nước Morris Dụng cụ thí nghiệm là một bể hình trụ, đường kính 1,1m và cao 30 cm. Lượng nước trong bể duy trì ở mức 15 cm, nhiệt độ khoảng 25oC trong suốt quá trình thí nghiệm. Nước được làm đục bằng sữa không đường. Một bến đỗ hình trụ trong suốt, có đường kính 7,5 cm và được đặt tại một góc phần tư của mê lộ. Mê lộ được đặt trong phòng kín. Toàn bộ quá trình được ghi nhận bằng camera. Dụng cụ được minh họa trong hình 10.4. Hình 10.4. Dụng cụ thí nghiệm trong test mê lộ nước Morris xxxviii PHỤ LỤC 11 QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG HOẠT ĐỘ ENZYM ACHE TRONG DỊCH NGHIỀN ĐỒNG THỂ MÔ NÃO CHUỘT Ngay sau khi phẫu thuật, mô não được rửa nhanh qua nước muối sinh lý lạnh, cân khối lượng và nghiền đồng thể trong dung dịch đệm phosphat 100 mM, pH = 7,5 (tỷ lệ 1:10), bảo quản trong điều kiện lạnh (0 - 4oC). Triton X-100 được thêm vào dịch nghiền đồng thể đến nồng độ 1% rồi đem ly tâm lạnh ở 0oC với tốc độ 10.000 rpm/phút trong 30 phút. Phần dịch nổi sau ly tâm được coi là nguồn enzym để định lượng hoạt độ enzym AChE. Phản ứng định lượng được thực hiện trên đĩa 96 giếng ở nhiệt độ 25oC. Hỗn hợp phản ứng trong mỗi giếng bao gồm: Nguồn enzym: DTNB 0,8 mM: ATCI 0,9 mM: Đệm phosphat 100 mM; pH = 7,5: 30 µl 40 µl 30 µl 100 µl Động học của phản ứng được theo dõi bằng cách đo mật độ quang của các giếng tại bước sóng 412 nm với tần suất 2 phút/lần trong thời gian 10 phút. - Thông số đánh giá Hoạt độ enzym AChE trong mô não được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hoạt độ (UI)/g não. Trong đó, một đơn vị hoạt độ AChE được định nghĩa là lượng enzym xúc tác cho sự hình thành 1 µmol thiocholin mỗi phút tại pH 7,5 ở nhiệt độ phòng. Công thức tính hoạt độ enzym AChE trong mô não: Hoạt độ AChE (UI) = ∆OD/phút × 200 0,0136 × 0,6 × k 30 × m Trong đó: ΔOD/phút: Thay đổi mật độ quang mỗi phút của giếng chứa hỗn hợp phản ứng 200: Thể tích hỗn hợp phản ứng trong mỗi giếng (µl) 0,0136: Hệ số hấp thụ micromol phân tử của phức tạo thành sau phản ứng tại bước sóng 412 nm (µM-1.cm-1) xxxix 0,6: Độ cao của dung dịch trong mỗi giếng (cm) k: Hệ số pha loãng 30: Thể tích nguồn enzym trong hỗn hợp phản ứng (µL) m: Khối lượng mô não (g) xl PHỤ LỤC 12 PHÂN LOẠI ĐỘNG HỌC ỨC CHẾ ENZYM Động học ức chế enzym AChE được xây dựng dựa trên đồ thị Lineweaver – Burk biểu thị biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất, cụ thể là mối tương quan giữa (1/nồng độ cơ chất ATCI, ký hiệu là 1/[ATCI]) và (1/tốc độ phản ứng, ký hiệu là 1/v). Dựa vào sự thay đổi của hằng số Michalis Menten (Km) và tốc độ phản ứng cực đại (vmax) khi có mặt của chất ức chế, có thể chia động học ức chế enzym AChE thành hai nhóm bao gồm [29], [177]: - Nhóm ức chế thuận nghịch được đặc trưng bởi sự phân ly nhanh chóng của phức hợp enzym-chất ức chế. Các dược liệu thường ức chế enzym AChE theo kiểu ức chế thuận nghịch, được chia thành các phân nhóm: + Ức chế cạnh tranh là chất ức chế và cơ chất cạnh tranh gắn vào trung tâm hoạt động của enzym. Chất ức chế liên kết với enzym AChE ngăn enzym kết hợp với cơ chất. Đường thẳng có chất kìm hãm (+ I) có độ dốc lớn hơn đường thẳng không có chất kìm hãm (- I). Khi có mặt chất ức chế thì Km tăng nhưng vmax không thay đổi. + Ức chế cạnh tranh không hoàn toàn là chất ức chế chỉ liên kết với phức hợp enzym-cơ chất, mà không liên kết với enzyme tự do. Đường thẳng có hoặc không có chất kìm hãm có độ dốc như nhau. Khi có mặt chất ức chế thì Km giảm và vmax cũng giảm. + Ức chế không cạnh tranh là chất ức chế không những liên kết với enzyme tự do mà còn liên kết với cả phức hợp enzym-cơ chất. Có hai loại ức chế không cạnh tranh là: • Ức chế không cạnh tranh đơn thuần: Khi có mặt chất ức chế thì Km không đổi và vmax giảm • Ức chế không cạnh tranh hỗn hợp: Khi có mặt chất ức chế thì Km tăng hoặc giảm và vmax giảm. - Nhóm ức chế không thuận nghịch được đặc trưng bởi sự phân ly rất chậm của phức hợp enzym-chất ức chế. xli Hình 12.1. Đồ thị Lineweaver – Burk biểu thị biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất của ức chế enzym theo kiểu thuận nghịch [177] A: Ức chế cạnh tranh, B: Ức chế cạnh tranh không hoàn toàn, C: Ức chế không cạnh tranh đơn thuần, D: Úc chế không cạnh hỗn hợp xlii PHỤ LỤC 13 QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG HÀM LƯỢNG MDA TRONG DỊCH NGHIỀN ĐỒNG THỂ MÔ NÃO CHUỘT Ngay sau khi phẫu thuật, mô não được rửa nhanh qua nước muối sinh lý lạnh, cân khối lượng và nghiền đồng thể trong dung dịch đệm phosphat 100 mM, pH = 7,5 và bảo quản trong điều kiện lạnh (0 - 4oC). Butylat hydroxytoluen 0.5M được thêm vào dịch nghiền đồng thể mô não, trộn đều rồi đem ly tâm lạnh ở 0oC với tốc độ 10.000 rpm/phút trong 15 phút. Phản ứng được thực hiện trong các ống nghiệm thủy tinh có nắp với mỗi hỗn hợp phản ứng bao gồm: 150µL phần dịch nổi sau ly tâm/tetramethoxypropan chuẩn/nước cất, 1mL acid thiobarbituric 0,5% và 1mL nước cất được đun cách thủy trong 60 phút ở nhiệt độ ≥ 95oC. Dung dịch sau phản ứng được chiết qua n-butanol, lớp n-butanol được cho vào ống có Na2SO4 khan, đem ly tâm trong 5 phút rồi hút 200 µL/mẫu đem đo quang ở bước sóng 532 nm. - Thông số đánh giá: Hàm lượng MDA trong mô não chuột được xác định từ phương trình đường chuẩn của tetramethoxypropan theo công thức sau: Hàm lượng MDA (nmol/g mô) = a x V 0,75 x m x b Trong đó: a: Số mol MDA tính được từ phương trình hồi quy với chất chuẩn tetramethoxypropan V: Thể tích dịch nghiền đồng thể não (mL) 0,75: Thể tích dịch nổi chứa MDA đưa vào hỗn hợp phản ứng (mL) b: Hệ số pha loãng m: Khối lượng mô não (g)
File đính kèm:
- luan_an_nghien_cuu_tac_dung_theo_huong_dieu_tri_alzheimer_tr.pdf
- 2. Tom tat Luận án_NCS Tran Thi Loan.pdf
- 3.Các cong trinh cong bo_NCS Tran Thi Loan.pdf
- 4. Đóng góp mới_Tiếng việt.pdf
- 5. Đóng góp mới_Tiếng anh.pdf
- 6. TRÍCH YẾU LUẬN ÁN_Tiếng việt.pdf
- 7. TRÍCH YẾU LUẬN ÁN_Tiếng anh.pdf