Luận án Thiết lập chất đối chiếu Hypophyllanthin, Niranthin và xác định một số thông số dược động học của cao chuẩn hóa điều chế từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. et Thonn., Euphorbiaceae)
Việt Nam có kinh nghiệm từ lâu đời về việc sử dụng dược liệu và chế phẩm
có nguồn gốc dược liệu để điều trị bệnh. Nhiều dược liệu đã được sử dụng từ rất lâu
qua kinh nghiệm dân gian, kiến thức y học cổ truyền, bài thuốc gia truyền,. Diệp hạ
châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. et Thonn., Euphorbiaceae) là một trong
những dược liệu được sử dụng rất phổ biến và đã được công nhận sử dụng chẳng
những theo Y học Việt Nam mà còn khắp nơi trên thế giới với tác dụng chính là cải
thiện chức năng gan ở các đối tượng viêm gan do nhiều nguyên nhân khác nhau, đặc
biệt là viêm gan B [4], [21], [53], [56], [76], [100].
Tổ chức y tế thế giới và Dược điển các nước đều đã đưa ra các yêu cầu kiểm
tra chất lượng các thuốc từ dược liệu phải dựa trên các kỹ thuật phân tích hiện đại,
với việc sử dụng các chất đối chiếu phù hợp [103]. Dược điển Việt Nam V đã có
chuyên luận Diệp hạ châu đắng và cao đặc Diệp hạ châu đắng [2]. Dược điển Mỹ
hiện hành cũng đã có các chuyên luận dược liệu Diệp hạ châu đắng, bột Diệp hạ châu
đắng [98]. Các chuyên luận trên đều có các chỉ tiêu định tính, định lượng sử dụng
chất chuẩn đối chiếu là chất điểm chỉ phyllanthin.
Hiện nay, trên thị trường nhiều sản phẩm từ Diệp hạ châu đắng, chủ yếu được
bào chế từ nguyên liệu là cao toàn phần, với công dụng là có hiệu quả trong tác dụng
bảo vệ gan. Tất cả những sản phẩm này đều công bố chất lượng dựa trên tiêu chuẩn
cơ sở tự xây dựng. Đa số, các tiêu chuẩn cơ sở của các thành phẩm được xây dựng
chỉ dựa trên việc định lượng hỗn hợp toàn phần bằng phương pháp không đặc hiệu,
không đưa được chỉ tiêu định lượng các hợp chất có hoạt tính sinh học cũng như chưa
xác định mức hàm lượng cho các chất có hoạt tính trong liều điều trị do thiếu chất
chuẩn đối chiếu và chưa có nghiên cứu về dược động học của các chất có hoạt tính
sinh học cho các sản phẩm từ dược liệu này. Trong khi tác dụng sinh học của Diệp
hạ châu đắng không chỉ do phyllanthin mà còn có hypophyllanthin và niranthin. Các
chất này có vai trò hết sức quan trọng trong tác dụng bảo vệ gan, kháng viêm, chống
ung thư [30], [67].2
Bên cạnh đó, công tác tiêu chuẩn hóa dược liệu hay sản phẩm từ dược liệu còn
tương đối khó khăn và đang còn bỏ ngõ trong lĩnh vực kiểm nghiệm do thiếu phương
pháp thử, chất chuẩn đối chiếu, cao chuẩn đối chiếu,. Mặt khác, các chất chuẩn đối
chiếu chưa sẵn có và giá thành rất cao; phương pháp thử cũng cần xây dựng cho phù
hợp với trình độ khoa học kỹ thuật chung của cả thế giới để nâng cao chất lượng các
sản phẩm trên. Ngoài ra, nghiên cứu sinh khả dụng nhằm đánh giá các thông số dược
động học của chế phẩm từ Diệp hạ châu đắng sẽ giúp minh chứng hỗ trợ điều trị bảo
vệ gan hiệu quả hơn.
Do đó, việc phân lập các chất có hoạt tính sinh học làm chất đối chiếu, tiêu
chuẩn hóa cao Diệp hạ châu đắng cũng như xác định sinh khả dụng của chế phẩm để
làm cơ sở cho việc kiểm tra chất lượng và ước định liều dùng cho các sản phẩm từ
Diệp hạ châu đắng là hết sức cần thiết. Từ các lý do trên, đề tài “Thiết lập chất đối
chiếu hypophyllanthin, niranthin và đánh giá một số thông số dược động học của cao
chuẩn hóa điều chế từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. et Thonn.,
Euphorbiaceae)” được thực hiện với các mục tiêu cụ thể như sau:
- Chiết xuất, phân lập, tinh chế hypophyllanthin, niranthin từ Diệp hạ châu
đắng (Phyllanthus amarus Schum. et Thonn.).
- Thiết lập chất đối chiếu hypophyllanthin, niranthin từ Diệp hạ châu đắng
(Phyllanthus amarus Schum. et Thonn.).
- Điều chế và tiêu chuẩn hóa cao Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus
Schum. et Thonn.).
- Đánh giá một số thông số dược động học của cao chuẩn hóa điều chế từ Diệp
hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. et Thonn.)
302 trang
17/08/2022
13100
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Luận án Thiết lập chất đối chiếu Hypophyllanthin, Niranthin và xác định một số thông số dược động học của cao chuẩn hóa điều chế từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. et Thonn., Euphorbiaceae)", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
Tóm tắt nội dung tài liệu: Luận án Thiết lập chất đối chiếu Hypophyllanthin, Niranthin và xác định một số thông số dược động học của cao chuẩn hóa điều chế từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. et Thonn., Euphorbiaceae)
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH PHẠM VĂN SƠN THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU HYPOPHYLLANTHIN, NIRANTHIN VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THÔNG SỐ DƯỢC ĐỘNG HỌC CỦA CAO CHUẨN HÓA ĐIỀU CHẾ TỪ DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG (PHYLLANTHUS AMARUS SCHUM. ET THONN., EUPHORBIACEAE) LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH PHẠM VĂN SƠN THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU HYPOPHYLLANTHIN, NIRANTHIN VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THÔNG SỐ DƯỢC ĐỘNG HỌC CỦA CAO CHUẨN HÓA ĐIỀU CHẾ TỪ DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG (PHYLLANTHUS AMARUS SCHUM. ET THONN., EUPHORBIACEAE) NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 62720410 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. NGUYỄN NGỌC VINH TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố ở bất kỳ nơi nào. Tác giả luận án Phạm Văn Sơn i MỤC LỤC MỤC LỤC .............................................................................................................. i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................. iii DANH MỤC BẢNG ............................................................................................. vii DANH MỤC HÌNH, ĐỒ THỊ ................................................................................. x DANH MỤC SƠ ĐỒ............................................................................................. xii MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3 1.1. TỔNG QUAN DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG ................................................... 3 1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VỀ CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP, TINH CHẾ HỢP CHẤT LIGNAN TỪ DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG ............... 9 1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CÁC HỢP CHẤT LIGNAN TRONG DIỆP HẠ CHÂU ........................................................................ 17 1.4. CAO ĐỐI CHIẾU..................................................................................... 25 1.5. TỔNG QUAN VỀ ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG CỦA THUỐC ......... 25 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 34 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .................................................................. 34 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................. 36 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 62 3.1. CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP, TINH CHẾ VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC, ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC ............................. 62 3.2. XÁC ĐỊNH CHẤT LƯỢNG VÀ THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU .......... 80 3.3. ĐIỀU CHẾ VÀ TIÊU CHUẨN HÓA CAO DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG ...... 84 3.4. ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ THÔNG SỐ DƯỢC ĐỘNG HỌC CỦA CAO CHUẨN HÓA ĐIỀU CHẾ TỪ DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG ............................. 101 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ................................................................................. 117 4.1. CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP, TINH CHẾ VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC, ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC ............................ 117 4.2. XÁC ĐỊNH CHẤT LƯỢNG VÀ THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU ........ 122 4.3. ĐIỀU CHẾ VÀ TIÊU CHUẨN HÓA CAO DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG .... 123 ii 4.4. ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ THÔNG SỐ DƯỢC ĐỘNG HỌC CỦA CAO CHUẨN HÓA ĐIỀU CHẾ TỪ DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG ............................................. 134 ĐIỂM MỚI CỦA ĐỀ TÀI .............................................................................. 145 KẾT LUẬN ........................................................................................................ 146 KIẾN NGHỊ ........................................................................................................ 149 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ................ 150 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 151 DANH MỤC PHỤ LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Từ nguyên Nghĩa tiếng Việt ACN Acetonitrile As Asymetry Hệ số đối xứng AUC Area under the plasma drug concentration - time curve Diện tích dưới đường cong thời gian - nồng độ thuốc trong huyết tương Cmax Maximum plasma concentration Nồng độ đỉnh trong huyết tương COSY Correlated Spectroscopy Phổ tương quan proton - proton CV Coefficient of Variation Hệ số phân tán d Doublet Đỉnh đôi DAZ Diazepam DCM Dichloromethan dd Doublets of doublet Đỉnh đôi kép DĐVN Dược điển Việt Nam DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DHCĐ Diệp hạ châu đắng DNA Deoxyribonucleic acid DSC Differential Scanning Calorimetry Phân tích nhiệt vi sai EA Ethyl acetate ECD Electrochemical detection Đầu dò điện hóa EMA European Medicines Agency Cơ quan Dược phẩm Châu Âu ESI Electrospray ionization Ion hóa phun điện EtOAc Ethyl acetate iv EtOH Ethanol FL Fluorescence Huỳnh quang GC Gas chromatography Sắc ký khí GC-MS Gas chromatography–mass spectrometry Sắc ký khí ghép nối khối phổ GLP Good Laboratory Practices Thực hành tốt phòng kiểm nghiệm thuốc GMP Good Manufacturing Practices Thực hành tốt sản xuất thuốc HMBC Heteronuclear multiple bond correlation Phổ tương tác dị nhân qua nhiều nối HPL Hypophyllanthin HPTLC High Performance Thin Layer chromatography Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HQC High quality control Mẫu kiểm chứng nồng độ cao HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation Phổ tương tác dị nhân qua một lượng tử ICH The International Council for Harmonisation Hội nghị quốc tế về hòa hợp IR Infrared Hồng ngoại IS Internal standard Chuẩn nội ISO International Organization for Standardization Tổ chức quốc tế về tiêu chuẩn hóa J Coupling constant Hằng số ghép LC-MS/MS Liquid chromatography - Tandem mass spectrometry Sắc ký lỏng ghép nối khối phổ LLOQ Lower limit of quantitation Giới hạn định lượng dưới LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện v LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng LQC Low quality control Mẫu kiểm chứng nồng độ thấp m Multiplet Đỉnh đa MAE Microwave Assisted Extraction Chiết xuất với sự hỗ trợ của vi sóng MeOH Methanol MF Matrix factor Hệ số ảnh hưởng nền mẫu MQC Medium quality control Mẫu kiểm chứng nồng độ trung bình MRM Multiple Reaction Monitoring MS Mass Spectrum Phổ khối NCBI National Center for Biotechnology Information Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia NLĐC Nguyên liệu đối chiếu NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân NOESY Nuclear overhauser effect spectrocopy Phổ hiệu ứng hạt nhân overhauser NRT Niranthin NTT Nirtetralin PA Purify analysis Tinh khiết phân tích PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase PDA Photo Diode Array Dãy diod quang PLE Pressurized Liquid Extraction Chiết dưới áp suất cao PLT Phyllanthin ppm Parts per million Một phần triệu PTN Phòng thí nghiệm PTT Phyltetralin QC Quality Control Mẫu kiểm chứng vi Rs Resolution Độ phân giải RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard deviation Độ lệch chuẩn SFE Super-critical Fluid Extraction Chiết xuất bằng chất lỏng siêu tới hạn SKC Sắc ký cột SKD Sinh khả dụng SKĐ Sắc ký đồ SKĐC Sắc ký điều chế SKLM Sắc ký lớp mỏng t Triplet Đỉnh ba T1/2 Terminal half-life Nửa đời thải trừ TB Trung bình TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng TLTK Tài liệu tham khảo Tmax Time to maximum plasma concentration Thời gian nồng độ trong huyết tương đạt mức tối đa tR Retention time Thời gian lưu TT Thuốc thử ULOQ Upper limit of quantitation Giới hạn định lượng trên US-FDA United States - Food and drug administration Cơ quan Quản lý Thuốc và Thực phẩm Hoa Kỳ USP United States Pharmacopeia Dược điển Mỹ UV Ultraviolet Tử ngoại UV-Vis Ultraviolet - Visible Tử ngoại - Khả kiến VLC Vacuum liquid chromatography Sắc ký lỏng chân không vii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Thành phần hóa học trong Diệp hạ châu đắng .......................................... 5 Bảng 1.2. Tác dụng sinh học cây Diệp hạ châu đắng ............................................... 8 Bảng 1.3. Các công trình chiết xuất, phân lập các hợp chất lignan ......................... 16 Bảng 1.4. Các phương pháp định lượng các hợp chất lignan .................................. 24 Bảng 1.5. So sánh hướng dẫn của US-FDA và EMA ............................................. 31 Bảng 2.1. Danh sách các trang thiết bị, vật tư sử dụng ........................................... 35 Bảng 2.2. Trình tự các cặp mồi dùng cho phản ứng PCR ....................................... 37 Bảng 2.3. Chương trình chạy PCR ......................................................................... 37 Bảng 2.4. Điều kiện sắc ký điều chế ban đầu ......................................................... 40 Bảng 2.5. Liều uống thuốc cho từng thỏ ................................................................ 60 Bảng 3.1. Kết quả kiểm tra chất lượng dược liệu nghiên cứu ................................. 62 Bảng 3.2. Kết quả search blast NCBI cặp mồi ITS1 – ITS4 ................................... 63 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát các dung môi chiết ...................................................... 64 Bảng 3.4. Kết quả sắc ký cột của 3 loại cao ........................................................... 64 Bảng 3.5. Kết quả phân lập sắc ký cột cao DCM ................................................... 65 Bảng 3.6. Kết quả chạy sắc ký cột phân đoạn IV ................................................... 66 Bảng 3.7. Khảo sát điều kiện SKĐC phân đoạn VII............................................... 67 Bảng 3.8. Khảo sát điều kiện SKĐC phân đoạn XII............................................... 68 Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập bằng SKLM ...................... 70 Bảng 3.10. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập bằng HPLC ..................... 71 Bảng 3.11. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết các chất phân lập bằng DSC ................. 71 Bảng 3.12. So sánh các dữ liệu phổ NMR của chất PA2 và niranthin ..................... 72 Bảng 3.13. So sánh các dữ liệu phổ NMR của chất PA3 và nirtetralin .................... 74 Bảng 3.14. Dữ liệu phổ NMR của chất PA4 và hypophyllanthin ............................ 76 Bảng 3.15. So sánh các dữ liệu phổ NMR của chất PA5 và phyltetralin ................. 78 viii Bảng 3.16. Dữ liệu phổ NMR của chất PA6 và phyllanthin .................................... 79 Bảng 3.17. Kết quả thẩm định phương pháp xác định độ tinh khiết hypophyllanthin ...................................... ... ộ ổn định chu kỳ đông-rã đông: Bảo quản sau 3 chu kỳ đông-rã đông. - Độ ổn định sau khi xử lý mẫu (trong bộ phận tiêm mẫu): Bảo quản sau khi xử lý mẫu 24 giờ trong buồng tiêm mẫu ở 5 oC. Kết quả đánh giá độ ổn định của PLT, HPL và NRT trong huyết tương được trình bày ở Bảng 3.8. Bảng 3.8 Độ ổn định của PLT, HPL và NRT trong huyết tương (n = 6) Điều kiện bảo quản Phần trăm giá trị tìm lại so với nồng độ lý thuyết (CV %) PLT HPL NRT IS LQC HQC LQC HQC LQC HQC Điều kiện ngắn hạn Sau 6 giờ ở nhiệt độ phòng TB 112,37 98,95 111,54 105,30 113,08 99,78 - CV (%) 3,64 5,73 5,25 4,31 4,23 6,30 Sau khi xử lý mẫu trong buồng tiêm mẫu 24 giờ ở 5 oC TB 114,28 99,80 116,45 107,10 115,54 99,03 102,52 CV (%) 4,07 3,41 6,64 3,69 3,86 5,36 1,33 Sau 3 chu kỳ đông-rã đông TB 110,75 106,14 106,56 107,21 101,43 105,98 - CV (%) 2,28 2,38 5,84 5,72 5,78 8,01 Điều kiện dài hạn Sau 30 ngày ở -70 oC TB 106,11 107,83 99,16 107,99 105,29 106,77 - CV (%) 6,55 4,47 3,57 5,07 4,49 6,56 Nhận xét: Giá trị tìm lại của các chất nằm trong khoảng 85 % - 115 % của nồng độ lý thuyết với giá trị CV đều không quá 15 %. Như vậy, mẫu huyết tương giả lập chứa PLT, HPL, NRT và IS đạt các chỉ tiêu ổn định theo hướng dẫn của US-FDA, EMA và DĐVN V, cụ thể như sau: ổn định sau 6 giờ bảo quản ở nhiệt độ phòng, 24 giờ trong bộ phận tiêm mẫu sắc ký ở 5 oC, sau 3 chu kỳ đông - rã đông và sau 30 ngày bảo quản ở -70 oC. 3.8. Ảnh hưởng của nền mẫu (Matrix effects) Tiến hành phân tích song song 6 lô mẫu huyết tương trắng đã xử lý rồi thêm IS và chất phân tích ở 2 nồng độ LQC và HQC, với mẫu LQC và HQC có chuẩn nội trong dung môi hòa cắn để tính ảnh hưởng của nền mẫu. Ảnh hưởng của nền mẫu đối với các chất phân tích được trình bày ở Bảng 3.9. PL-119 Bảng 3.9. Kết quả đánh giá sự ảnh hưởng của nền mẫu (n = 6) Mức nồng độ Ảnh hưởng nền mẫu MFPLT MFHPL MFNRT MFIS MFPLT/MFIS MFHPL/MFIS MFNRT/MFIS LQC 73,75 82,12 79,81 84,95 0,87 0,97 0,94 77,80 96,32 75,95 85,39 0,91 1,13 0,89 79,65 74,73 83,36 87,24 0,91 0,86 0,96 70,15 76,23 73,85 89,24 0,79 0,85 0,83 73,17 87,77 72,19 94,90 0,77 0,92 0,76 77,86 93,82 71,04 85,32 0,91 1,10 0,83 TB 75,40 85,16 76,03 87,84 0,86 0,97 0,87 CV (%) 7,64 12,18 8,57 HQC 169,78 84,68 98,48 102,74 103,85 96,46 173,88 88,15 96,56 99,28 101,73 99,56 159,40 82,90 91,03 96,04 95,44 98,10 171,05 87,08 97,90 98,08 99,42 97,15 159,38 83,83 98,47 101,07 101,42 96,89 168,78 86,74 96,58 99,36 100,20 97,22 TB 167,05 85,57 96,50 99,43 100,34 97,56 CV (%) 3,57 3,07 3,32 Nhận xét: Tỷ số MFPLT/ MFIS, MFHPL/ MFIS và MFNRT/ MFIS ở mức nồng độ LQC và HQC có giá trị CV đều < 15 %. Như vậy, phương pháp phân tích tuy có bị ảnh hưởng bởi nền mẫu nhưng nằm trong giới hạn cho phép nên vẫn đạt yêu cầu về ảnh hưởng của nền mẫu. 3.9. Ảnh hưởng của lượng mẫu tồn dư (Carry over) Tiến hành thử nghiệm lượng mẫu tồn dư để kiểm tra sự có mặt của chất phân tích từ lần tiêm trước đó (độ nhiễm chéo). Các mẫu được tiêm theo thứ tự sau: mẫu có nồng độ cao nhất (ULOQ) và mẫu trắng, lặp lại 6 lần. Tiêm 6 lần mẫu LLOQ để đánh giá kết quả. Bảng 3.10 trình bày kết quả khảo sát ảnh hưởng của lượng mẫu tồn dư. Bảng 3.10. Kết quả đánh giá sự ảnh hưởng của lượng mẫu tồn dư (n = 6) Chất phân tích Mức nồng độ Diện tích pic trung bình Lượng mẫu tồn dư (%) PLT LLOQ 144961 0,00 ULOQ 133182318 Mẫu trắng 0 HPT LLOQ 24711 0,00 ULOQ 21265567 Mẫu trắng 0 NRT LLOQ 99686 0,00 ULOQ 85249808 Mẫu trắng 0 IS LLOQ 2558048 0,00 PL-120 Chất phân tích Mức nồng độ Diện tích pic trung bình Lượng mẫu tồn dư (%) ULOQ 2553734 Mẫu trắng 0 Nhận xét: Kết quả ở Bảng 3.10 cho thấy, không có sự ảnh hưởng của mẫu tồn dư đối với PLT, HPL, NRT và IS. 3.10. Hệ số pha loãng Chuẩn bị 6 mẫu huyết tương giả lập ở nồng độ gấp 2 lần nồng độ HQC, sau đó pha loãng 2 lần bằng huyết tương trắng, xử lý mẫu và tiến hành phân tích. Kết quả phân tích đánh giá sự ảnh hưởng của việc pha loãng với hệ số pha loãng là 2 được trình bày ở Bảng 3.11. Bảng 3.11. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của sự pha loãng (n = 6) Mẫu Nồng độ lý thuyết (ng/mL) Nồng độ thực tế (ng/mL) Tỷ lệ thu hồi (%) PLT HPL NRT PLT HPL NRT PLT HPL NRT 1 799,91 769,28 160,08 758,37 784,01 140,81 94,81 98,13 87,96 2 733,88 755,51 147,81 91,74 94,56 92,34 3 796,31 848,97 177,16 99,55 106,26 110,67 4 781,01 847,11 178,30 97,64 106,03 111,38 5 791,77 864,47 181,59 98,98 108,20 113,44 6 816,19 835,96 171,47 102,04 104,63 107,12 TB 97,46 102,97 103,82 CV (%) 3,77 5,22 10,47 Nhận xét: Khi được pha loãng 2 lần, tỷ lệ thu hồi PLT, HPL và NRT lần lượt là 97,46 %; 102,97 % và 103,82 % (giới hạn cho phép 85 % - 115%) với giá trị CV của tỷ lệ thu hồi lần lượt là 3,77 %; 5,22 % và 10,47 % (≤ 15 %). Vậy quy trình xử lý mẫu đã xây dựng không bị ảnh hưởng bởi độ pha loãng. Kết luận: Kết quả thẩm định cho thấy quy trình định lượng đồng thời phyllanthin, hypophyllanthin và niranthin trong huyết tương thỏ bằng kỹ thuật LC- MS/MS với khoảng tuyến tính nồng độ các chất phân tích 1-1000 ng/ml đã được xây dựng và thẩm định đáp ứng các yêu cầu theo hướng dẫn của US-FDA, EMA và DĐVN V về thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học. PL-121 PHỤ LỤC 15. KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI PHYLLANTHIN, HYPOPHYLLANTHIN VÀ NIRANTHIN TRONG HUYẾT TƯƠNG THỎ BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS Tiến hành phân tích mẫu huyết tương thỏ theo quy trình đã được thẩm định (Phụ lục 14). Phân tích dược động học dựa trên các dữ liệu của 12 con thỏ. Kết quả nồng độ các chất phân tích phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin được trình bày ở Bảng 1, Bảng 2 và Bảng 3. Đồ thị biểu diễn nồng độ chất trung bình theo thời gian được trình bày ở Hình 1, Hình 2 và Hình 3. Đồ thị biểu diễn nồng độ các chất phân tích phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin theo thời gian của từng cá thể được trình bày ở Hình 4. Từ nồng độ chất trong huyết tương ở các thời điểm, tính toán các thông số dược động học của từng cá thể và dược động học trung bình, kết quả được trình bày ở Bảng 4. Bảng 1. Nồng độ phyllanthin trong huyết tương của từng cá thể (ng/mL) Nồng độ Phyllanthin (PLT) ở từng thời điểm (ng/mL) Thỏ t0 t1 t2 t3 t4 t5 t6 t7 t8 t9 t10 t11 t12 t13 0 5 10 15 20 30 45 1h 2 h 3h 4h 5h 6h 8h 1 0 9,054 11,575 14,056 7,787 5,447 3,720 2,742 1,054 0,591 0,373 0,261 0,132 0,098 2 0 10,139 8,635 8,399 7,564 6,740 2,775 2,294 1,153 0,500 0,492 0,116 - - 3 0 8,241 10,255 16,063 11,590 6,652 2,110 1,204 1,138 0,453 0,328 0,227 0,200 0,123 4 0 5,041 9,001 13,701 11,066 6,235 2,553 2,003 1,027 0,789 0,473 0,172 0,132 0,100 5 0 8,294 10,670 14,342 10,860 6,322 4,638 2,474 1,350 0,349 0,271 0,126 0,105 - 6 0 9,588 10,496 14,177 9,792 6,363 4,538 2,880 1,096 0,789 0,234 0,184 0,132 - 7 0 6,208 7,302 16,941 8,575 5,396 2,621 2,334 0,852 0,673 0,467 0,060 - - 8 0 8,753 10,857 16,780 9,759 6,178 4,557 2,016 1,480 0,520 0,472 0,160 0,121 - 9 0 7,067 9,651 16,650 9,529 6,987 4,932 2,841 0,846 0,534 0,312 0,234 0,108 - 10 0 5,282 9,392 14,730 11,063 7,065 4,074 1,356 0,988 0,734 0,351 0,077 - - 11 0 5,472 9,713 13,532 9,459 5,108 2,568 2,026 1,177 0,534 0,574 0,224 0,189 0,136 12 0 9,131 10,417 14,383 11,596 5,082 2,241 1,551 1,203 0,513 0,344 0,113 0,080 - TB 0 7,689 9,830 14,480 9,887 6,131 3,444 2,143 1,114 0,582 0,391 0,163 0,140 0,120 SD - 1,80 1,15 2,28 1,40 0,71 1,06 0,56 0,18 0,14 0,10 0,07 0,04 0,02 PL-122 Hình 1. Đồ thị biểu diễn nồng độ phyllanthin trung bình theo thời gian Bảng 2. Nồng độ hypophyllanthin trong huyết tương của từng cá thể (ng/mL) Nồng độ Hypophyllanthin (HPL) ở từng thời điểm (ng/mL) Thỏ t0 t1 t2 t3 t4 t5 t6 t7 t8 t9 t10 t11 t12 t13 0 5 10 15 20 30 45 1h 2 h 3h 4h 5h 6h 8h 1 0 3,029 4,784 5,183 3,37 2,714 1,709 1,109 0,638 0,509 0,249 - - - 2 0 2,334 4,027 6,098 4,426 1,223 1,58 0,997 0,717 0,521 0,196 - - - 3 0 2,378 3,027 6,189 3,849 1,753 1,243 1,098 0,603 0,435 0,188 0,095 - - 4 0 2,045 4,241 5,055 4,845 1,8 1,178 0,748 0,512 0,338 0,271 0,071 - - 5 0 1,318 2,623 4,073 4,58 1,815 1,482 1,094 0,552 0,344 0,093 - - - 6 0 2,252 2,834 4,935 3,544 2,491 1,668 0,813 0,694 0,525 0,196 0,084 - - 7 0 2,442 3,462 7,131 4,31 1,678 1,254 1,159 0,798 0,38 0,142 0,073 - - 8 0 2,043 4,655 6,14 4,954 1,705 1,574 0,922 0,5 0,356 0,08 0,042 - - 9 0 3,445 3,381 5,872 4,367 1,183 1,084 0,985 0,74 0,407 0,229 0,089 - - 10 0 3,156 3,662 6,503 3,961 2,365 1,687 0,904 0,687 0,611 0,227 0,098 - - 11 0 1,871 3,321 7,007 4,666 2,277 1,973 1,161 0,86 0,77 0,155 0,021 - - 12 0 1,835 3,719 6,265 4,697 1,928 1,32 1,168 0,76 0,582 0,176 0,052 - - TB 0 2,346 3,645 5,871 4,297 1,911 1,479 1,013 0,672 0,482 0,184 0,069 - - SD - 0,61 0,68 0,90 0,51 0,47 0,27 0,14 0,11 0,13 0,06 0,03 - - Hình 2. Đồ thị biểu diễn nồng độ hypophyllanthin trung bình theo thời gian PL-123 Bảng 3. Nồng độ niranthin trong huyết tương của từng cá thể (ng/mL) Nồng độ Niranthin (NRT) ở từng thời điểm (ng/mL) Thỏ t0 t1 t2 t3 t4 t5 t6 t7 t8 t9 t10 t11 t12 t13 0 5 10 15 20 30 45 1h 2 h 3h 4h 5h 6h 8h 1 0 1,865 3,118 3,942 2,31 1,824 1,179 0,899 0,335 0,259 0,26 0,181 0,112 - 2 0 2,306 4,298 4,819 1,949 1,666 1,085 0,557 0,387 0,247 0,154 0,092 - - 3 0 1,567 2,58 4,426 1,889 1,489 1,101 0,69 0,315 0,26 0,109 0,082 - - 4 0 1,238 4,432 4,021 2,024 1,957 0,994 0,881 0,713 0,421 0,232 0,051 - - 5 0 2,087 2,908 4,019 1,191 1,801 1,016 0,767 0,552 0,471 0,268 0,092 - - 6 0 2,242 2,677 3,682 1,814 1,531 1,051 0,511 0,796 0,259 0,133 0,114 - - 7 0 1,732 3,474 3,96 1,761 1,184 1,09 0,685 0,46 0,378 0,174 0,118 - - 8 0 1,734 4,379 4,705 2,042 1,841 1,048 0,694 0,412 0,433 0,292 0,09 - - 9 0 1,433 2,367 4,959 1,967 1,523 1,051 0,725 0,689 0,293 0,152 0,118 - - 10 0 1,308 3,68 4,581 1,975 1,236 0,983 0,804 0,61 0,500 0,115 0,098 - - 11 0 1,923 4,101 5,129 2,415 1,643 1,026 0,717 0,317 0,435 0,292 0,090 - - 12 0 1,13 4,242 3,638 1,584 1,036 0,982 0,882 0,585 0,342 0,149 0,100 - - TB 0 1,714 3,521 4,323 1,91 1,561 1,051 0,734 0,514 0,358 0,194 0,102 0,112 - SD - 0,39 0,77 0,51 0,32 0,29 0,06 0,12 0,17 0,09 0,07 0,03 - - Hình 3. Đồ thị biểu diễn nồng độ niranthin trung bình theo thời gian Bảng 4. Các thông số dược động học trung bình của các chất Thông số Phyllanthin (Trung bình ± SD) Hypophyllanthin (Trung bình ± SD) Niranthin (Trung bình ± SD) Tmax (giờ) 0,24 0,26 0,24 Cmax (ng/mL) 14,625 ± 1,88 5,913 ± 0,82 4,408 ± 0,45 AUC0-t (ng.giờ/mL) 9,694 ± 0,71 4,172 ± 0,39 3,135 ± 0,24 AUC0-∞ (ng.giờ/mL) 10,150 ± 0,61 4,503 ± 0,42 3,497 ± 0,38 T1/2 (giờ) 1,78 1,17 1,41 AUC0-t/AUC0-∞ (%) 95,51 92,65 89,66 PL-124 Đồ thị biểu diễn nồng độ các chất của từng cá thể theo thời gian: Thỏ PLT HPL NRT 1 2 3 4 5 6 PL-125 7 8 9 10 11 12 Hình 4. Đồ thị biểu diễn nồng độ phyllanthin, hypophyllanthin và niranthin theo thời gian của từng cá thể
File đính kèm:
- luan_an_thiet_lap_chat_doi_chieu_hypophyllanthin_niranthin_v.pdf
- PHẠM VĂN SƠN.pdf
THÔNG TIN ĐƯA LÊN MẠNG-NCS-PHẠM VĂN SƠN.doc- TÓM TẮT LUẬN ÁN-NCS-PHẠM VĂN SƠN.pdf
