Luận án Thực trạng, căn nguyên viêm não vi rút và chi phí điều trị trực tiếp cho người bệnh tại 3 tỉnh Tây Bắc Việt Nam, 2017-2018

i 
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ 
VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG 
-----------------*------------------- 
VŨ VI QUỐC 
THỰC TRẠNG, CĂN NGUYÊN VIÊM NÃO VI RÚT 
VÀ CHI PHÍ ĐIỀU TRỊ TRỰC TIẾP 
CHO NGƯỜI BỆNH TẠI 3 TỈNH TÂY BẮC 
VIỆT NAM, 2017 - 2018 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y TẾ CÔNG CỘNG 
HÀ NỘI – 2021 
ii 
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ 
VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG 
-----------------*------------------- 
VŨ VI QUỐC 
THỰC TRẠNG, CĂN NGUYÊN VIÊM NÃO VI RÚT 
VÀ CHI PHÍ ĐIỀU TRỊ TRỰC TIẾP 
CHO NGƯỜI BỆNH TẠI 3 TỈNH TÂY BẮC 
VIỆT NAM, 2017 - 2018 
Chuyên ngành: Y TẾ CÔNG CỘNG 
Mã số: 62 72 03 01 
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y TẾ CÔNG CỘNG 
 Người hướng dẫn khoa học: 
 1. PGS.TS TRẦN NHƯ DƯƠNG 
 2. TS. HOÀNG MINH ĐỨC 
HÀ NỘI – 2021 
i 
LỜI CAM ĐOAN 
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi với sự hợp tác của đồng 
nghiệp và đã được sự đồng ý của Chủ nhiệm đề tài cấp Bộ cho công bố luận án này. 
Kết quả nghiên cứu trong luận án là trung thực và chưa từng công bố trong bất 
kỳ một công trình nào khác. 
Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về những lời cam đoan này. 
 Hà Nội, ngày .... tháng ..... năm 2021 
 Tác giả luận án 
 Vũ Vi Quốc 
ii 
LỜI CẢM ƠN 
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng cảm ơn: PGS.TS. Trần Như 
Dương, Phó Viện trưởng, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương và TS. Hoàng Minh 
Đức, Phó Cục trưởng Cục Y tế dự phòng, Bộ Y tế là những người thầy đã tận 
tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập, xây dựng 
đề cương, thu thập, phân tích số liệu, viết báo cáo và hoàn thiện luận án. 
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban lãnh đạo Viện Vệ sinh dịch 
tễ trung ương, Khoa Dịch tễ, Khoa Côn trùng và Động vật y học, Khoa Vi rút, 
Trung tâm Đào tạo và Quản lý khoa học - Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương đã 
hỗ trợ, tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập 
triển khai nghiên cứu trên thực địa, trong phòng thí nghiệm và hoàn thiện luận 
án. 
Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo Sở Y tế, lãnh đạo và cán bộ Trung 
tâm kiểm soát bệnh tật, các bệnh viện thuộc 3 tỉnh Tây Bắc: Sơn La, Điện Biên 
và Lào Cai đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong quá trình tổ chức triển khai, thu thập 
số liệu, luôn tạo điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình nghiên cứu, hoàn thiện 
luận án. 
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Cục Khoa học công nghệ và Đào 
tạo, Bộ Y tế đã hỗ trợ tài chính cho nghiên cứu này. 
Tôi xin được tri ân những tình cảm vô bờ của bà, bố mẹ, vợ con tôi và 
các bạn bè, đồng nghiệp đã giúp đỡ và động viên tôi trong những ngày tháng 
học tập và nghiên cứu. 
Hà Nội, ngày .... tháng ..... năm 2021 
 Nghiên cứu sinh 
 Vũ Vi Quốc 
iii 
MỤC LỤC 
 Trang 
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi 
DANH MỤC BẢNG viii 
DANH MỤC HÌNH ix 
ĐẶT VẤN ĐỀ 1 
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 
1.1. Một số điểm đại cương về Viêm não vi rút 3 
1.1.1. Khái niệm hội chứng Viêm não cấp và Viêm não vi rút 3 
1.1.2. Một số loại Viêm não vi rút thường gặp 3 
1.1.3. Nguồn truyền nhiễm với các tác nhân truyền qua véc tơ 4 
1.1.4. Phương thức lây truyền 4 
1.1.5. Tính cảm nhiễm 4 
1.1.6. Đặc điểm lâm sàng của Viêm não vi rút 4 
1.2. Thực trạng Viêm não vi rút trên thế giới và tại Việt Nam 6 
1.2.1. Thực trạng hội chứng viêm não cấp và Viêm não vi rút trên thế giới 6 
1.2.2. Thực trạng hội chứng viêm não cấp và Viêm não vi rút tại Việt Nam 16 
1.3. Tác nhân gây Viêm não vi rút 22 
1.3.1. Vi rút arbo gây Viêm não vi rút 23 
1.3.2. Vi rút đường ruột gây Viêm não vi rút 25 
1.3.3. Vi rút Herpes gây Viêm não vi rút 28 
1.4. Véc tơ muỗi truyền bệnh Viêm não vi rút và Viêm não Nhật Bản 33 
1.4.1. Muỗi véc tơ truyền Viêm não vi rút 33 
1.4.2. Muỗi véc tơ truyền bệnh Viêm não Nhật Bản 34 
1.5. Gánh nặng kinh tế và chi phí điều trị của bệnh Viêm não vi rút 36 
1.5.1. Gánh nặng của bệnh Viêm não vi rút 36 
1.5.2. Chi phí điều trị bệnh tật 38 
1.6. Giới thiệu địa điểm nghiên cứu 41 
1.6.1. Tỉnh Sơn La 41 
1.6.2. Tỉnh Điện Biên 42 
1.6.3. Tỉnh Lào Cai 43 
CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44 
2.1. Mục tiêu 1: Mô tả thực trạng của Viêm não vi rút tại 3 tỉnh Tây 
Bắc: Sơn La, Điện Biên và Lào Cai, 2017-2018 
44 
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 44 
2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 44 
iv 
2.1.3. Thiết kế nghiên cứu 45 
2.1.4. Cỡ mẫu 45 
2.1.5. Phương pháp và công cụ thu thập thông tin 45 
2.1.6. Các biến số và chỉ số nghiên cứu 46 
2.2. Mục tiêu 2: Xác định một số tác nhân vi rút gây viêm não và sự có 
mặt của muỗi truyền bệnh Viêm não Nhật Bản tại 3 tỉnh Tây Bắc: Sơn La, 
Điện Biên và Lào Cai, 2017-2018. 
47 
2.2.1. Xác định một số tác nhân vi rút gây viêm não 47 
2.2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 47 
2.2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 47 
2.2.1.3. Thiết kế nghiên cứu 47 
2.2.1.4. Cỡ mẫu 47 
2.2.1.5. Phương pháp và công cụ thu thập thông tin 47 
2.2.1.6. Tóm tắt các quy trình xét nghiệm 48 
2.2.1.7. Các biến số và chỉ số nghiên cứu 63 
2.2.2. Xác định sự có mặt của muỗi truyền bệnh Viêm não Nhật Bản tại 
khu vực nghiên cứu 
63 
2.2.2.1. Đối tượng nghiên cứu 63 
2.2.2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 63 
2.2.2.3. Thiết kế nghiên cứu 64 
2.2.2.4. Cỡ mẫu 64 
2.2.1.5. Phương pháp và công cụ thu thập thông tin 64 
2.2.2.6. Các biến số và chỉ số nghiên cứu 65 
2.3. Mục tiêu 3: Xác định chi phí điều trị trực tiếp cho người bệnh Viêm 
não vi rút tại các cơ sở y tế ở 3 tỉnh Tây Bắc: Sơn La, Điện Biên và Lào 
Cai, 2017-2018 
66 
2.3.1. Đối tượng nghiên cứu 66 
2.3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 66 
2.3.3. Thiết kế nghiên cứu 67 
2.3.4. Cỡ mẫu 67 
2.3.5. Phương pháp và công cụ thu thập thông tin 67 
2.3.6. Nội dung và phương pháp phân tích chi phí 67 
2.3.7. Các biến số và chỉ số nghiên cứu 68 
2.4. Xử lý số liệu 68 
2.5. Sai số và cách hạn chế sai số 69 
2.6 Đạo đức nghiên cứu 69 
v 
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 70 
3.1. Thực trạng của Viêm não vi rút tại 3 tỉnh Tây Bắc: Sơn La, Điện Biên 
và Lào Cai, 2017-2018 
70 
3.1.1. Phân bố bệnh Viêm não vi rút theo địa dư 70 
3.1.2. Phân bố bệnh Viêm não vi rút theo thời gian 73 
3.1.3. Phân bố bệnh Viêm não vi rút theo giới tính 76 
3.1.4. Phân bố bệnh Viêm não vi rút theo nhóm tuổi 77 
3.1.5. Phân bố ca bệnh Viêm não vi rút theo nghề nghiệp 78 
3.1.6. Phân bố ca bệnh Viêm não vi rút theo trình độ học vấn 79 
3.1.7. Phân bố ca bệnh Viêm não vi rút theo dân tộc 81 
3.1.8. Một số đặc điểm dịch tễ của các ca bệnh tử vong do Viêm não vi rút 82 
3.2. Một số tác nhân vi rút gây viêm não và sự có mặt của muỗi truyền 
bệnh Viêm não Nhật Bản tại 3 tỉnh Tây Bắc: Sơn La, Điện Biên và Lào 
Cai, 2017-2018 
84 
3.2.1. Một số tác nhân vi rút gây viêm não tại 3 tỉnh Tây Bắc: Sơn La, 
Điện Biên và Lào Cai, 2017-2018 
84 
3.2.2. Sự có mặt của muỗi truyền bệnh Viêm não Nhật Bản tại khu vực 
nghiên cứu 
93 
3.3. Chi phí điều trị trực tiếp liên quan đến y tế của người bệnh Viêm não 
vi rút điều trị tại các cơ sở y tế ở 3 tỉnh Tây Bắc: Sơn La, Điện Biên và 
Lào Cai, 2017-2018 
102 
3.3.1. Chi phí trực tiếp cho điều trị Viêm não vi rút 105 
3.3.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến chi phí điều trị trực tiếp cho y tế của 
người bệnh Viêm não vi rút 
107 
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 109 
4.1. Thực trạng của Viêm não vi rút tại 3 tỉnh Tây Bắc: Sơn La, Điện Biên 
và Lào Cai, 2017-2018 
109 
4.1.1. Tỷ lệ mắc VNVR ở Tây Bắc, Việt Nam, 2017 - 2018 110 
4.1.2. Diễn biến bệnh Viêm não vi rút tại 3 tỉnh Tây Bắc, Việt Nam, 2017 
– 2018 theo thời gian 
112 
4.1.3. Phân bố ca bệnh Viêm não vi rút theo một số yếu tố dịch tễ (tuổi, 
giới tính, nghề nghiệp, dân tộc, trình độ học vấn) 
124 
4.2. Một số tác nhân vi rút gây viêm não và muỗi truyền bệnh Viêm não 
Nhật Bản tại 3 tỉnh Tây Bắc, 2017-2018 
117 
4.2.1. Một số tác nhân vi rút gây viêm não tại 3 tỉnh Tây Bắc, 2017-2018 
117 
vi 
4.2.2. Sự có mặt của muỗi truyền bệnh Viêm não Nhật Bản tại khu vực 
nghiên cứu 
127 
4.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của muỗi véc tơ 133 
4.3. Chi phí trực tiếp cho y tế của người bệnh Viêm não vi rút tại các cơ 
sở y tế ở 3 tỉnh Tây Bắc: Sơn La, Điện Biên và Lào Cai, 2017-2018 
135 
4.3.1 Chi phí trực tiếp cho y tế của người bệnh Viêm não vi rút 135 
4.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến chi phí điều trị trực tiếp cho y tế của 
người bệnh Viêm não vi rút 
137 
KẾT LUẬN 138 
KIẾN NGHỊ 140 
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ 
CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
PHỤ LỤC 
vii 
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 
ARN 
CI 
Axist ribonucleic 
Khoảng tin cậy 
Confidence Interval 
Cx Culex 
CSMĐ Chỉ số mật độ 
DCCN Dụng cụ chứa nước 
EBV Vi rút Epstein Barr (vi rút Herpes 4) Epstein Barr Virus 
ELISA Kỹ thuật miễn dịch gắn men Enzyme-linked 
Immunosorbent Assay 
hCMV 
HCVNC 
Vi rút Cytomegalo 
Hội chứng Viêm não cấp 
Human Cytomegalovirus 
HSV Vi rút Herpes Simplex Herpes Simplex Virus 
NPEV Các vi rút đường ruột không phải polio Non-Polio Enterovirus 
PCR Phản ứng khuyếch đại chuỗi 
polymerase 
Polymerase Chain 
Reaction 
PTN 
PV 
Phòng thí nghiệm 
Phỏng vấn 
SL 
RdRP 
Số lượng 
ARN polymease phụ thuộc ARN 
RNR dependent RNR 
polymerase 
TB Trung bình 
TCM Tay chân miệng 
TTYTDP 
VNNB 
Trung tâm Y tế dự phòng 
Viêm não Nhật Bản 
Japanese Encephalitis 
VNVR Viêm não vi rút 
VRĐR Vi rút đường ruột 
VSDTTƯ Vệ sinh dịch tễ Trung ương 
viii 
DANH MỤC BẢNG 
 Trang 
Bảng 1.1 Phân bố ca bệnh hội chứng não cấp do VNNB và không do 
VNNB tại Dibrugarh, Ấn Độ, 2015 – 2016 
16 
Bảng 1.2. Các tác nhân phổ biến gây viêm não do vi rút 23 
Bảng 2.1. Các loại mẫu bệnh phẩm, thời gian và số lượng, loại xét 
nghiệm phát hiện tác nhân gây bệnh 
73 
Bảng 3.1. Tỷ lệ chết/mắc do VNVR tại 3 tỉnh Tây Bắc, 2017-2018 91 
Bảng 3.2. Phân bố các ca tử vong do VNVR theo các tác nhân gây bệnh 
tại 3 tỉnh Tây Bắc, 2017 – 2018 
92 
Bảng 3.3. Tỷ lệ chết/mắc do VNVR theo giới tính tại 3 tỉnh Tây Bắc, 
2017 – 2018 
92 
Bảng 3.4. Phân bố các mẫu bệnh phẩm thu thập được theo loại bệnh 
phẩm 
93 
Bảng 3.5. Kết quả xét nghiệm tác nhân vi rút ở người bệnh VNVR 94 
Bảng 3.6. Kết quả xét nghiệm tác nhân vi rút ở người bệnh nghiên cứu 
tại 3 tỉnh Sơn La, Điện Biên và Lào Cai 
95 
Bảng 3.7. Phân bố các loại tác nhân phát hiện được trong các mẫu dương 
tính 
96 
Bảng 3.8 Phân bố các loại tác nhân vi rút phát hiện được trong các mẫu 
dương tính tại tỉnh Sơn La, Điện Biên và Lào Cai, 2017-2018 
97 
Bảng 3.9. Phân bố tác nhân ở các mẫu dịch não tuỷ có xét nghiệm dương 
tính 
98 
Bảng 3.10. Phân bố tác nhân ở các mẫu huyết thanh có xét nghiệm dương 
tính 
98 
Bảng 3.11. Phân bố tác nhân ở các mẫu phân có xét nghiệm dương tính 99 
Bảng 3.12. Các loài muỗi thu thập được tại các điểm nghiên cứu 103 
Bảng 3.13. Chỉ số mật độ các loài muỗi Culex thu thập trên thực địa, 2018 108 
Bảng 3.14. Phân bố bọ gậy của muỗi Culex theo thủy vực thu thập trên 
thực địa, 2018 
109 
Bảng 3.15. Một số yếu tố liên quan đến số lượng muỗi Culex thu thập 
trên thực địa, 2018 
110 
Bảng 3.16. Yếu tố liên quan đến số lượng bọ  ... 
14. Hồ sơ 
Stt Tên hồ sơ 
Đơn vị lưu 
trữ 
Hình thức 
lưu 
Thời gian 
lưu 
1 Hồ sơ phiếu yêu cầu xét nghiệm PTN Arbo 
Văn bản 5 năm 
Điện tử 10 năm 
2 Hồ sơ xét nghiệm PTN Arbo 
Văn bản 5 năm 
Điện tử 10 năm 
3 
Hồ sơ phiếu trả kết quả xét 
nghiệm 
PTN Arbo 
Văn bản 5 năm 
Điện tử 10 năm 
4 
Hồ sơ theo dõi trả kết quả xét 
nghiệm 
PTN Arbo 
Văn 
bản/điện 
tử 
5 năm 
5 Sổ theo dõi người bệnh PTN Arbo 
Văn bản 5 năm 
Điện tử 10 năm 
15. Tài liệu tham khảo 
- QIAGEN One Step RT-PCR Kit Handbook, 2002 
- SuperScript III Platinum One-Step QUantitative RT-PCR system 
lxxxix 
- Molecular Virology and reference Laboratory. Realtime RT-PCR for detection and 
serotype identification of dengue virus, 2011. 
- Application of Reverse Transcriptase – Polymerase chain reaction (RT-PCR) to 
detection of arboviruses, diagnosis of arbovirus infection and research. 
- Rapid Dection and typing of Dengue Viruses from clinical samples by using Reverse 
Transcriptase – Polymerase Chain Reaction. 
- Typing of Dengue viruses in clinical Speciments and Mosquitoes by Single –Tube 
Multiplex Reverse Transcriptase PCR. 
- Thông tư số 53/2017/TT-BYT quy định thời hạn bảo quản hồ sơ, tài liệu chuyên 
môn nghiệp vụ ngành y tế ban hành ngày 29/12/2017. 
xc 
QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN HSV 
• Chất lượng của sinh phẩm: Sinh phẩm được sử dụng trong nghiên cứu này là 
sinh phẩm chuẩn thức, đã được thương mại hóa, có thường quy chuẩn thức và 
cụ thể của nhà sản xuất. Sinh phẩm được đặt mua từ những nhà cung cấp có 
uy tín trên Thế giới, với sinh phẩm tách chiết ADN là Qiagen (Đức), với sinh 
phẩm cho phản ứng khuếch đại gien là Applied Biosystems, với vật liệu tiêu 
hao như đầu côn lọc và tube nhựa là AB gene, Corning, và Eppendorf, tất cả 
đều đạt tiêu chuẩn Quốc tế. 
• Trang thiết bị máy móc : Chúng tôi sử dụng những trang thiết bị máy móc của 
các nhà cung cấp máy móc có uy tín như máy ly tâm lạnh tốc độ cao của 
Hettich, máy khuếch đại gien AB Applied Biosystems 7500. 
• Chứng dương được sản xuất theo trình tự chuẩn : từ PCR cổ điển, tạo dòng để 
có được plasmid tái tổ hợp, biến nạp vào hệ thống E.coli, tách chiết plasmid 
và tính toán cụ thể dựa vào cấu trúc ADN để có được chính xác số lượng bản 
sao ADN HSV trong một đơn vị thể tích khuôn mẫu phản ứng. 
Thường quy thực hiện thử nghiệm là của phòng thí nghiệm hay đã được chuẩn 
thức hóa và thương mại hóa: Khu vực ổn định nhất của gien UL30 là khu vực đích 
cần khuếch đại, vì mục tiêu của đề tài là phát hiện tỷ lệ có mặt ADN HSV-1 và -2 
trong dịch não tủy của người bệnh viêm não và viêm màng não, vừa góp phần giúp 
bác sỹ lâm sàng điều trị cho người bệnh, vừa giúp nhà hoạch định chính sách trong 
xây dựng phác đồ giám sát và điều trị viêm não, viêm màng não do HSV, đoạn gien 
đích cần khuếch đại này vừa có tính ổn định, vừa chung cho cả HSV-1 và HSV-2 nên 
giúp làm giảm cả kinh phí và thời gian trong chẩn đoán HSV, giúp phản ứng kịp thời 
cho điều trị. 
Trên thực tế, phác đồ điều trị 2 típ HSV là hoàn toàn giống nhau nên việc phân 
biệt típ HSV không có nhiều ý nghĩa trong điều trị như trong nghiên cứu. Cặp mồi 
đặc hiệu và đầu dò này không phải là do phòng thí nghiệm tìm ra và áp dụng lần đầu 
mà là ứng dụng kết quả nghiên cứu của một trong số những tác giả có kinh nghiệm 
xci 
nổi tiếng nhất trong lĩnh vực này là Kessler và cộng sự, kết quả nghiên cứu này cũng 
đã được đăng tải trong những tạp chí và những đầu sách có uy tín là “J Clin Microbiol 
38, 2638-42 (2000)” và “real-time PCR” (2000). Một điều nữa để chứng minh tính 
tin cậy của cặp mồi và đầu dò đặc hiệu này là có rất nhiều tác giả, cơ sở nghiên cứu, 
bệnh viện lâm sàng danh tiếng (của Hoa kỳ và Cộng hòa Pháp, Hà Lan) đã và đang 
áp dụng chúng cho những nghiên cứu và công tác chẩn đoán phòng thí nghiệm của 
mình. Độ đặc hiệu của phản ứng được đánh giá bằng các nghiên cứu trước đây, độ 
nhạy của phản ứng được đánh giá qua gam chuẩn ngoài. Cặp mồi và đầu dò khuếch 
đại đoạn gien đích thuộc khu vực ổn định của ADN polymerase, một gien chỉ có mặt 
khi vi rút hoạt động nên có tính khẳng định vai trò gây bệnh của HSV. 
Chi tiết: 
1. Quy trình: Tách chiết ADN vi rút theo thường quy của bộ sinh phẩm 
bằng phương pháp ly tâm. 
Bước 1. Bật máy ly tâm Hettich trước khi tách chiết 15 phút; 
Bước 2. Lấy từ tủ -30oC ống Eppendorf đã có sẵn 20 μl dung dịch PK, chuẩn 
bị 1 ống cho 1 mẫu bệnh phẩm, làm tan nhanh dung dịch PK. Đánh dấu ống theo ký 
hiệu mẫu; 
Bước 3. Thêm 200 μl bệnh phẩm cần tách chiết (dịch bọng nước, dịch mắt, 
dịch não tủy); 
Bước 4. Thêm 200 μl dung dịch đệm AL. Trộn đều bằng máy lắc trong 15 
giây; 
* Chú ý: Nếu bệnh phẩm ít hơn 200 μl thì thêm đệm PBS vừa đủ 200 μl, nếu bệnh 
phẩm nhiều hơn 200 μl thì tăng lượng PK và đệm AL theo tỷ lệ tương ứng. Không 
thêm trực tiếp PK vào đệm AL. 
Bước 4. Ủ ống 10 phút ở 56oC; 
Bước 5. Ly tâm nhẹ; 
Bước 6. Thêm 200 μl ethanol 96-100%, lắc đều 15 giây và ly tâm nhẹ. Tổngthể 
tích trong ống Eppendorf là 20 + 200 + 200 + 200 = 620μl; 
* Chú ý: Nếu bệnh phẩm nhiều hơn 140 μl thì tăng lượng ethanol theotỷ lệ tương 
xcii 
ứng. 
Bước 7. Bóc cột lọc và ghi ký hiệu mẫu (nắp và thành ống); 
Bước 8. Cẩn thận chuyển toàn bộ 620 μl sang cộtlọc đã ghi số mẫu (nắp và 
thành ống) và ly tâm cột 8000 vòng/phút x 1 phút, bỏ dịch trong ống hứng, giữ lại 
cột lọc; 
Bước 9. Đặt cột lọc vào một ống hứng sạch và thêm 500 µl dung dịch 
rửaAW1, ly tâm cột 8000 vòng/phút x 1 phút, bỏ dịch trong ống hứng, giữ lại cột 
lọc; 
* Chú ý: Dù bệnh phẩm nhiều hơn 200 μl cũng không cần thiết phải tăng lượng AW1. 
Bước 10. Đặt cột lọc vào một ống hứng sạch và thêm 500 μl dung dịch 
rửaAW2, ly tâm cột 14.000 vòng/phút x 3 phút, bỏ dịch trong ống hứng, giữ lại cột 
lọc; 
Bước 11. Đặt cột lọc vào một ống hứng sạch và ly tâm cột 14.000 vòng/phút 
x1 phút, bỏ ống hứng, giữ lại cột lọc; 
Bước 13. Đặt cột lọc vào một ống Eppendorf 1,5ml sạch, tách ADN từ cột lọc bằng 
thêm 200μl dung dịch đệm AE (nếu bệnh phẩm là dịch mắt hoặc dịch não tủy thì thêm 50 
μl dung dịch đệm AE), để ở nhiệt độ phòng thí nghiệm 1 phút và ly tâm 8000 vòng/phút x 
1 phút. Bỏ cột lọc, bảo quản ADN trong ở -20oC hoặc -80oC. 
2. Quy trình real-time PCR: 
Bước 1.Pha hỗn dịch phản ứng (mix) và cho mẫu dưới hốt sinh học phân tử : 
Thành phần N=1 (µl) N= 
Master mix x 2 12,5 
Mồi xuôi 1 
Mồi ngược 1 
Đầu dò 0,5 
H2O 5 
Khuôn mẫu 5 
Tổng số 25 
xciii 
Bước 2. Xẻ hỗn dịch phản ứng vào các ống phản ứng 
- Cho vào mỗi ống phản ứng 20 μl; 
- Cho mẫu và chứng; 
- Chuyển các ống mẫu sang buồng chạy máy (Real-time). 
Bước 3. Chạy máy 
- Chọn chương trình HSV; 
- Cho mẫu vào máy; 
- Nhấnvào “Start”để chương trình bắt đầu chạy; 
- Lưu thông tin trên máy./. 
xciv 
QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM CHẨN ĐOÁN VI RÚT ĐƯỜNG RUỘT 
1. Mẫu bệnh phẩm 
Mẫu bệnh phẩm bao gồm mẫu phân và dịch não tủy. Mẫu bệnh phẩm được 
xem là hợp lệ và được PTN VRĐR chấp nhận để làm các xét nghiệm chẩn đoán 
VRĐR khi có phiếu điều tra được điền đầy đủ thông tin đi kèm. 
2. Phương pháp xử lý mẫu bệnh phẩm 
Mẫu phân: chuẩn bị hỗn dịch mẫu phân 20% trong môi trường PBS (+), xử lý 
cloroform trong 20 phút, ly tâm thu dịch nổi. Mẫu dịch não tủy: sử dụng trực tiếp 
không qua xử lý. Mẫu bệnh phẩm đã xử lý sẽ được bảo quản tại -20oC và -80oC cho 
các thí nghiệm tiếp theo. Các giai đoạn thao tác với mẫu bệnh phẩm đều phải được 
thực hiện trong tủ ATSH cấp 2, phòng thí nghiệm ATSH cấp 2. 
3. Tách chiết vật liệu di truyền RNA của vi rút: 
ARN của vi rút sẽ được tách chiết từ dịch nổi bệnh phẩm phẩm đã xử lý hoặc 
từ dịch não tủy, sử dụng bộ sinh phẩm tách chiết thương mại High Pure Viral RNA 
Kit (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA). Các bước tiến hành thực hiện theo 
quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất. ARN thu được sẽ được bảo quản ở -30oC và -
80oC cho các nghiên cứu tiếp theo. 
4. Xác định VRĐR chung, EV-A71, CV-A6, CV-A10 và CV-A16 bằng kỹ 
thuật RT-PCR đơn và đa mồi 
Phương pháp này cho phép xác định VRĐR chung và định danh bốn kiểu 
VRĐR lưu hành nổi trội gây bệnh TCM gồm EV-A71, CV-A6, CV-A10 và CV-A16. 
Phản ứng RT-PCR sử dụng cặp mồi được thiết kế trên vùng gen không mã hóa 5'-
UTR, đặc hiệu chung cho các VRĐR được sử dụng để xác định mẫu dương tính hoặc 
âm tính với VRĐR. Mẫu được xác định bốn tác nhân EV-A71, CV-A6, CV-A10 và 
CV-A16 bằng phản ứng RT-PCR đa mồi (multi-primer RT-PCR), gồm hai phản ứng 
riêng lẻ: (1) phản ứng RT-PCR thứ nhất sử dụng bộ mồi phát hiện vật liệu di truyền 
cho EV-A71 và CV-A6; (2) phản ứng thứ hai sử dụng bộ mồi phát hiện CV-A10 và 
xcv 
CV-A16. Các cặp mồi đều được thiết kế trên vùng VP1, mang tính đặc hiệu cho từng 
kiểu vi rút. 
Trình tự thực hiện các phản ứng như sau: DNA bổ sung (cDNA) được tổng 
hợp từ RNA, sử dụng mồi ngẫu nhiên của nhà sản xuất và bổ sung một hỗn hợp phản 
ứng phiên mã ngược có chứa 20 mM dNTP và 20 U/ml enzyme phiên mã ngược 
SuperScriptTM III transcriptase để tạo nên một khối lượng cuối cùng của 20 µl. 
cDNA được tổng hợp theo các điều kiện nhiệt độ: 25oC trong 5 phút; 42oC trong 60 
phút; 70oC trong 15 phút. cDNA tiếp tục được sử dụng cho các phản ứng PCR để 
phát hiện VRĐR chung và hai phản ứng PCR đa mồi để phát hiện EV-A7, CV-A6, 
CV-A10, và CV-A16). Mỗi phản ứng bao gồm 5μl cDNA, 0,6 μM mồi đặc hiệu vi 
rút cần phát hiện và 12,5μl GoTaq® Green Master Mix System (Promega), tổng thể 
tích phản ứng là 25 μl. Chạy phản ứng tại máy luân nhiệt theo các chu kỳ sau: 95oC/5 
phút, tiếp theo là 50 chu kỳ PCR ở 94oC/1 min; 45oC/2 phút; 72oC/3 phút; và một chu 
kỳ cuối cùng ở 72oC/8 phút. Các sản phẩm PCR đặc hiệu được xác định bằng điện di 
trên thạch 2%. 
5. Định danh các VRĐR khác bằng phương pháp snRT-PCR/sequencing 
Các mẫu dương tính với VRĐR nhưng âm tính với EV-A71, CV-A6, CV-A10 
và CV-A16 sẽ được tiếp tục định danh bằng phương pháp snRT-PCR/sequencing 
vùng gen VP1. Các VRĐR khác này bao gồm các vi rút Coxsackie nhóm A khác, vi 
rút Coxsackie B, vi rút ECHO và các VRĐR mới phát hiện Quy trình xét nghiệm 
như sau: cDNA được tổng hợp sử dụng bộ mồi ngược đặc hiệu VRĐR, AN32-AN35. 
cDNA được sử dụng cho phản ứng PCR 1 với cặp mồi SO222/SO224 chung cho các 
VRĐR được thiết kế trên vùng VP1 tạo sản phẩm PCR khoảng 700 bp. Phản ứng 
PCR 2 sử dụng cặp mồi thiết kế bên trong vùng khuyếch đại của PCR 1, cặp mồi 
AN88/AN89, tạo sản phẩm PCR dài khoảng 350 bp. Sản phẩm PCR được điện di để 
xác định sau đó được tinh sạch và thực hiện phản ứng PCR gắn huỳnh quang sử dụng 
một mồi. Sản phẩm gắn huỳnh quang được tinh sạch khỏi chất nhuộm còn thừa và 
được giải trình tự chuỗi nucleotide bằng máy ABI 3100-Avant. Các trình tự quang 
xcvi 
phổ được lắp đặt bằng phần mềm Sequencer, kết nối trình tự được thực hiện bằng 
chương trình Lasergene 8 (DNAstar, Inc. Madison,WI, USA). Các trình tự gen thu 
được sẽ được tiến hành định danh trên trang web phân tích tự động thiết kế cho vi rút 
đường ruột của RIVM (https://www.rivm.nl/mpf/typingtool/enterovirus/).