Đề tài Tìm hiểu qui trình nuôi cấy in vitro trên cây hoa đồng tiền

 PHẦN MỞ ĐẦU
Người trồng hoa đồng tiền, bài toán lại ngả theo hướng hiệu quả kinh tế. Cần biết 
rằng, trồng hoa đồng tiền chỉ sau 3 tháng là đã được thu và sẽ thu liên tục trong 4-5 
năm rồi mới phải trồng lại. Nó lại cho hoa quanh năm.
Đồng tiền là loài hoa đẹp, nhiều màu sắc. Hoa của nó lớn vừa phải mà cuống lại 
dài nên dễ bó và dễ cắm. Ta có thể cắm thuần loại hoa đồng tiền hoặc cắm xen với 
các loại hoa khác. Hầu hết các lẵng hoa trang trí hiện nay đều có dùng hoa đồng 
tiền. Càng ngày, hoa đồng tiền càng được ưa chuộng và đòi hỏi với số lượng lớn. 
Giá của nó cũng cao. Vì vậy, ruộng hoa đồng tiền là nguồn thu nhập chính của 
nhiều gia đình nông dân.
Ở Hà Nội, Bắc Ninh, Hải Phòng, Hải Dương và ở Đà Lạt, đã có nhiều gia đình 
chọn nghề chính cho mình là trồng hoa đồng tiền. Hàng loạt giống hoa đồng tiền 
mới đã được các nhà khoa học tạo ra với kiểu dáng và màu sắc vượt trội. Khả năng 
chống chịu sâu bệnh, thời tiết của chúng cũng được nâng lên, phạm vi thích nghi 
cũng ngày càng được mở rộng...
Hoa đồng tiền dễ trồng và không khắt khe về các loại đất. Tuy nhiên, nếu đất tơi 
xốp, nhiều mùn và thoáng khí vẫn là loại đất thích hợp nhất. Phải lưu ý, tránh trồng 
hoa đồng tiền vào những chỗ bị ứ nước, tù đọng.
Hoa đồng tiền ưa khí hậu mát mẻ (từ 15-25oC). Tuy nhiên, cũng có những giống 
chịu được nhiệt độ cao (từ 30-34oC). Nhưng tốt nhất vẫn nên trồng nó trong vụ thu 
đông để có hoa to và đẹp. Ta cần lưu ý giảm cường độ ánh sáng vào những ngày 
nắng nóng cho cây (bằng cách dùng lưới đen căng trên luống).
Hoa đồng tiền tuy không chịu được úng, nhưng lại đòi hỏi lượng nước khá lớn. Độ 
ẩm đất cần giữ ở mức 60-70%. Như vậy, ta cũng phải lo tưới bổ sung thường 
xuyên cho chúng. Nếu bố trí được hệ thống tưới nhỏ giọt hoặc giàn phun mưa thì 
tốt nhất.
Hoa đồng tiền đòi hỏi khá nhiều phân (cả phân hữu cơ, phân vô cơ, và phân vi 
lượng). Sức sống của cây và chất lượng của hoa phụ thuộc rất nhiều vào phân bón. 
Ta phải lo từ 30-35 tấn phân chuồng hoai mục và khoảng 300kg NPK cho 1ha 
trồng hoa đồng tiền.
Cây hoa đồng tiền không chịu được mưa nhiều, sương muối và ánh sáng mạnh. Vì 
vậy, ta phải lo giàn che hoặc mái lợp nylon cho chúng. Trồng khoảng 60.000 
cây/ha. Chỉ sau 80-90 ngày là cây đã bắt đầu cho hoa. Cây sẽ sinh thêm nhiều nhánh. Mỗi nhánh ta tỉa và chỉ để lại 5 lá để nuôi hoa. Ta cũng nên ngắt bỏ các nụ 
xấu để tập trung sức cho các nụ khỏe. Nếu trồng tốt, mỗi năm ta cũng có thể thu 
được 50-100 hoa/cây.
Hoa đồng tiền có thể nhân giống bằng hạt, bằng tách cây hoặc bằng phương pháp 
nuôi cấy mô. Giống là yếu tố rất quyết định cho nên bà con phải hết sức thận trọng. 
Hiện đã có nhiều tài liệu viết về trồng hoa đồng tiền, bà con ta tìm đọc là sẽ làm 
được hết.
Chuyên gia Nguyễn Lân Hùng
Nhân giống in vitro - còn gọi là vi nhân giống là việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi 
cấy mô để nhân giống thực vật trong điều kiện vô trùng, bắt đầu bằng các mảnh cắt 
nhỏ ở nhiều bộ phận khác nhau của thực vật. Sau khi làm sạch vi sinh vật, những 
mảnh này được nuôi cấy vô trùng (trong ống nghiệm hoặc trong các loại bình nuôi 
cấy khác). Trong thực tế, thuật ngữ nhân giống in vitro và nuôi cấy mô được sử 
dụng để chỉ mọi phương thức nhân giống thực vật trong điều kiện vô trùng.
GS-TS Quang Thạch (Viện Sinh học nông nghiệp)
Xuất phát từ hai thự tiển trên em tiến hành thu thập các tài liệu nhằm củng cố về 
mặt kiến thức để tiến hành nuôi cấy in vitro trên cây hoa đồng tiền PHẦN THỔNG QUAN TÀI LIỆU
I.GIỚI THIỆU HOA ĐỒNG TIỀN
1. Cây Đồng Tiền
 Chi hoa Đồng Tiền (Gerbera) là một chi của một số loài cây cảnh trong họ 
 Cúc (Asteraceae). Tên gọi Gerbera được đặt theo tên nhà tự nhiên học người 
 Đức Traugott Gerber. Chi này có khoảng 30-100 loài sống hoang dã, phân 
 bố ở Nam Mỹ, châu Phi đại lục, Madagascar và vùng nhiệt đới châu Á. Miêu 
 tả khoa học dầu tiên vè chi Gerbera đã được J.D Hooker thực hiện trong tạp 
 chí thực vật Curtis năm 1889 khioong miêu tả Gerbera Jamesonii, một loài ở 
 Nam Phi được biết dưới tên gọi cúc Transvaal hay cúc Barberton.
 Ta có thể biết được cây đồng tiền có sơ đồ phân loại như sau:
 - Giới (regnum): Plantae
 - Ngành (diviso): Magnoliophyta
 - Lớp (class): Magnoliopsoda
 - Bộ (ordo): Asterales
 - Họ (familia): Asteraceae
 - Phân họ (subfamilia): Mutisioideae
 - Tông (tribus): Mutisieae
 - Chi (genus): Gerbera
2. Đặc điểm
 Các loài trong chi Gerbera có cụm hoa dạng đầu lớn với các chiếc hoa tia hai 
 môi nổi bật có màu vàng, da cam, trắng, hồng hay đỏ. Cụm hoa dạng đầu có 
 bề ngoài dường như là một bông hoa, trên thực tế là tập hợp của hàng tăm 
 hoa nhỏ riêng biệt. Hình thái của các hoa nhỏ phụ thuộc nhiều vào cị trí của 
 chúng trong cụm hoa.
 Hoa đồng tiền (gerbera) thuộc thân thảo, thân khoảng 1,5-2 cm, mọc trồi lên 
 mặt đất, lá dạng bẹ cao khoảng 15-30 c tùy giống cây và điều kiện chăm sóc, 
 mặt sau lá có lớp nhung màu trắng. Hoa nở quanh năm nhiều nhất vào mùa 
 hè và mùa thu.
 Các giống trồng tại vườn chủ yếu là lai ghép chéo giữa Gerbera Jamesonii 
 và một loài khác ở Nam Phi là Gerbera Viridifolia. Giống lai ghép chéo này 
 có tên khoa học là Gerbera Hybrida. Hiện nay tồn hàng trăm loại giống khác 
 nhau. Chúng dao động mạnh về hình dạng và kích thước hoa. Màu sắc có 
 thể là trắng, vàng, da cam, đỏ hay hồng. Ở phần trung tâm của bông hoa đôi khi có màu đen. Thông thường trên một hoa có cánh hoa có thể có vài màu 
khác nhau. II. GIỚI THIỆU NUÔI CẤY MÔ
1. Định nghĩa nuôi cấy mô
 Nuôi cấy mô là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy 
 nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng 
 nhân tạo ở điều kiện môi trường.
 Nhân gióng in vitro hay còn gọi vi nhân giống được sử dụng đặc biệt cho 
 việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu 
 bằng nhiều bộ phận khác nhau của thực vật có kích thươc nhỏ, sinh trưởng ở 
 điều kiện vô trùng trong các ống nghiệm hoặc trong các loại bình nuôi cấy 
 khác.
 Thực tế, các nhà vi nhân giống dùng thuật ngữ nhân giống in vitro và nuôi 
 cấy mô thay đôi cho nhau để chỉ cho mọi phương thức nhân giống thực vật 
 trong điều kiện vô trùng . Thuật ngữ đồng nghĩa là nuôi cấy in vitro
2. Cơ sở khoa học và thực nghiệm của nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro
 Năm 1838, nhà thực vật học Matthias Jacob Schleudeb và năm 1839 nhà 
 động vật học Theodor Schwann mới chính thức xây dựng học thuyết tế bào. 
 Schleiden và Schwas khẳng định rằng : Mỗi cơ thể động thực vật đều bao 
 gồm những thể tồn tại hoàn toàn độc lập, riêng lẽ và tách biệt, đó chính là tế 
 bào.
 Trên cơ sở đó, Haberlandt là người đầu tiên đề xướng r phương pháp nuôi 
 cấy tế bào thực vật năm 1902 đề chứng minh cho tính toàn thể của tế bào. 
 Theo ông mỗi tế bào bất kì của một thể sinh vật đều đa bào đều có tiềm tàng 
 để phát triển nhanh thành một cá thể sinh vật đa bào đều có tiềm tàng dể 
 phát triển nhanh thành một cá thể hoàn chỉnh trên môi trường dinh dưỡng 
 nhân tạo. Mặc dù vậy ông đã gặp thất bại trong các thí nghiệm của mình trên 
 các đối tượng: nuôi cấy tế bào đơn tách từ nhu mô lá, tượng tầng của tầng 
 biểu bì và lông hút của nhiều thực vật. Năm 1934, White nuôi cấy thành 
 công đầu rể cà chua (Lycopersicum esculentum) trong môi trường lỏng có 
 bổ sung muối khoáng, glucose, đầu rể sinh trưởng khá mạnh và tạo nên hệ rể 
 nhỏ có cả rể phụ. Nhưng sự sinh trưởng này chỉ xãy ra trong một thời gian 
 rồi chậm dần và ngường hẳn mặc dù đã chuyển sang môi trường mới. Cùng 
 trong thời gian này, Kogl lần đầu tiên xã định được xác định dược vai trò 
 của IAA, một hoocmon thực vật đầu tiên thuộc nhóm auxin có khả năng 
 kích thích sự tăng trưởng phân chia tế bào. Năm 1939, ba nhà khoa học 
 Gautheret, Nobecourt và White đã đồng thời nuôi cấy mô sẹo thành công 
 trong thời gian từ mô thượng tần ở cà rốt và thuốc lá, mô sẹo có khả năng sinh trưởng liên tục. Năm 1941, Overbeek và cs đã sữ dụng nước dừa trong 
nuôi cấy phôi non ở cây cà rốt Datura. Năm 1955, Miller và cs đã phát minh 
cấu trúc và sinh tổng hợp của kinetin – một cytokinin đóng vai trò quan 
trọng trong phân bào và phân hóa chồi ở mô nuôi cấy. Đến năm 1957, Skoog 
và Miller đã khám phá vai trò của tỷ lệ nồng độ các chất auxin: cytokinin 
trong môi trường đối với sự phát sinh cơ quan (rễ hoặc chồi). Khi tỷ lệ 
auxin/ cytokinin (ví dụ: nồng độ IAA/ nồng độ kinetin lớn hơn 1 và càng 
lớn, mô có xu hướng tạo rễ. Tỷ lệ nồng độ auxin và cytokinin thích hợp sẽ 
kích thích phân hóa cả chồi và rễ. Tỷ lệ nồng độ auxin và cytokinin thích 
hợp sẽ kích thích phân hóa cả chồi và rễ, tạo cây hoàn chỉnh.
 Công trình 1. (nguyễn thị nga, Nguyễn thị phương hoa )
Vật lieu nghiên cứu là tập đoàn 14 mẫu giống hoa đồng tiền nhập khẩu nội từ Côn 
Minh (TQ) dưới dạng cây cấy mô xuất vườn. Đây là những giống đang trồng phổ 
biến trong sản xuất và được người dung rất ưa chuộng. Trong đó, giống nhân giống 
chủ đạo là giống hoa kép, màu đỏ nhung, nhị màu nâu
Phương pháp nghiên cứu 
 - Các phương pháp nghiên cứu nuôi cấy mô hiện hành đã được sử dụng cho 
 nghiên cứu.
 - Phương pháp bố trí thí nghiệm và các chỉ tiêu theo dõi, điều tra đều được 
 tiến hành theo phương pháp nghiên cứu nông sinh học thông dụng. các thí 
 nghiệm đợc thự hiện trong phòng thí nghiệm, vườn thực nghiệm công nghệ 
 sinh học- viện sinh học nông nghiệp trường đại học nông nghiệp 1 hà nội
 - Để có nguồn cho quá trình nuôi cấy in vitro chúng tôi đã chọn lựa các cây 
 mẹ sạch bệnh, sinh trưởng và phát triển tốt để làm nguồn mẫu ban đầu.
1 vào mẫu
Được dung HgCl2 để khử trùng mẫu 
Bảng 1: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng và vị trs mẫu đến khả năng sống của 
mẫu cấy
Cơ quan nuôi Chỉ tiêu theo Thời gian khử trùng
cấy dỏi 3 phút 5 phút 7 phút
Thân Tỷ lệ mẫu 93.3 86.7 73.3
 nhiểm (%)
 Tỷ lệ mẫu chết 6.7 13.3 26.7
 (%)
 Tỷ lệ mẫu sống 0.0 0.0 0.0
 (%)
Cuống lá non Tỷ lệ mẫu 93.3 46.7 13.3
 nhiểm (%)
 Tỷ lệ mẫu chết 0.0 33.3 86.7
 (%)
 Tỷ lệ mẫu sống 6.7 20.0 0.0
 (%)
Lá non Tỷ lệ mẫu 86.7 66.7 3.3
 nhiểm (%)
 Tỷ lệ mẫu chết 0.0 26.7 96.7
 (%) Tỷ lệ mẫu sống 13.3 6.6 0.0
 (%)
Cuống hoa Tỷ lệ mẫu 80.0 46.8 6.7
 nhiểm (%)
 Tỷ lệ mẫu chết 6.7 20.0 93.3
 (%)
 Tỷ lệ mẫu sống 13.3 33.2 0.0
 (%)
Hoa non Tỷ lệ mẫu 66.7 33.3 13.3
 nhiểm (%)
 Tỷ lệ mẫu chết 0.0 26.7 86.7
 (%)
 Tỷ lệ mẫu sống 33.3 40.0 0.0
 (%)
Bảng 2. Ảnh hưởng của tổ hợp Benzyl adenine (BA) + Kinetin (K) + Indol acetic 
axit (IAA) đến sự phát triển hình thái của mẫu cấy ( sau 16 tuần nuôi cấy)
Công thức Sự phát sinh hình thái
 Lá non Cuống lá Hoa non Cuống hoa
 non
Đối chứng (ĐC) Mẫu có chết sau 2 chết sau 2 chết sau 2 
 màu xanh tuần tuần tuần
 chết sau 2 
 tuần
0.3ppm Mẫu có Chết Chết Chết
BA+0.2ppmK+0.2ppmIAA màu xanh 
 phồng chết 
 sau 2 tuần
0.5ppm Sùi callus Sùi callus Sùi callus Chết
BA+0.2ppmK+0.2ppmIAA 15% sau 10 5% sau 10 17%sau 9 
 tuần nuôi tuần nuôi tuần nuôi 
 cấy cấy cấy, có 
 6.7%tạo 
 thành chồi 
 sau 16 tuần 
 nuôi cấy
1.0ppm Sùi callus Sùi callus Sùi callus Chết
BA+0.2ppmK+0.2ppmIAA 23% sau 10 13% sau 10 25%sau 9 tuần nuôi tuần nuôi tuần nuôi 
 cấy cấy cấy, có 
 20%tạo 
 thành chồi 
 sau 16 tuần 
 nuôi cấy
1.5ppm Sùi callus Sùi callus Sùi callus Chết
BA+0.2ppmK+0.2ppmIAA 10% sau 10 7% sau 10 9% sau 8-10 
 tuần nuôi tuần nuôi tuần nuôi 
 cấy cấy cấy
2.0ppm Sùi callus Sùi callus Sùi callus Chết
BA+0.2ppmK+0.2ppmIAA 5% sau 10 3% sau 10 3% sau 8-10 
 tuần nuôi tuần nuôi tuần nuôi 
 cấy cấy cấy
2 Nhân nhanh
Sauk hi có được chồi non hình thành từ quá trình trên, tiến hành tách chồi non 
thành các cụm nhỏ từ 2-3 chồi trên cụm và đưa vào môi trường nuôi cấy có bổ 
sung riêng rẽ BA,Kinetin, đường saccharoza với các nồng độ khác nhau nhằm tìm 
ra môi trường thích hợp nhất cho quá trình nhân nhanh( kết quả thu được trình bày 
ở bảng 3) Nồng độ đường trong môi rường nuôi cấy 2.5% là tối ưu cho giai đoạn 
nhân nhanh.
Bảng 3. Ảnh hưởng của Kinetin đến quá trình nhân nhanh (sau 4 tuần nuôi cấy)
Công thức Hệ số nhân Chiều cao(cm) Số lá/cây
ĐC (MS) 1.44 1.67 3.44
MS+0.3ppmK 2.45 1.60 2.78
MS+0.3ppmK 3.09 2.27 3.36
MS+0.3ppmK 5.78 2.85 3.67
MS+0.3ppmK 2.67 2.02 3.33
MS+0.3ppmK 2.22 2.26 2.56
CV (%) 1.60 1.00 0.60
LSD (5%) 0.08 0.04 0.03 3 Ra rể
Bảng 4 Ảnh hưởng của αNAA đến quá trình ra rể 
Chỉ tiêu Tỷ lệ ra rể của chồi Số rể cây Chiều dài Chiều dài TB 
theo dỏi TB cây(cm)
Công thức Sau 1 Sau 2 rễ(cm) Ban đàu Sau 2 
 tuần tuần tuần
ĐC(MS) 0 100 4.30 0.50 4.00 5.80
MS+0.1ppm 20.0 100 8.30 0.60 4.00 6.00
αNAA
MS+0.1ppm 40.0 100 4.00 1.00 4.00 5.80
αNAA
MS+0.1ppm 20.0 100 3.70 0.80 4.00 5.50
αNAA
4 Ra vườn
Bảng 5. Ảnh hưởng của nền trồng đến tỷ lệ sống, sinh trưởng, phát triển của cây 
nuôi cấy mô giai đoạn vườn ươm( sau 4 tuần theo dõi)
Chỉ tiêu theo dõi Tỹ lệ sống (%) Chiều cao (cm) Số lá ( lá/cây)
Nền trồng
Đất phù sa sông 76.60 7.15 9.10
hồng 
Cát 91.33 6.90 9.10
Trấu hun 6.00 5.98 6.16
Mùn 83.33 7.35 8.59
Đất +mùn(1:1) 80.00 7.37 8.67
Cát + trấu hun 73.33 6.61 9.33
(1:1)
Mùn + trấu hun 93.25 7.50 9.50
(1:1)
Bảng 6 Ảnh hưởng của thời vụ trồng đến sự sinh trưởng của cây đồng tiền cấy mô 
ở vườn ươm (sau 4 tuần)