Báo cáo Tìm hiểu hoạt tính enzyme bromelain

 LỜI MỞ ĐẦU
 Hầu như mọi phản ứng hóa học trong cơ thể sống đều cần phải có vai trò xúc tác của 
enzyme – chất xúc tác sinh học. Chính vì vậy, những nghiên cứu về enzyme đã thu hút sự 
quan tâm của nhiều nhà khoa học ở các lĩnh vực liên quan khác nhằm tìm ra được những 
công dụng khác nhau của mỗi enzyme. Nghiên cứu về công nghệ enzyme đã được tiến hành 
bởi nhiều tác giả như sử dụng phủ tạng của lò mổ để sản xuất pancrease, pepsin, tripsin, sử 
dụng mầm mạ để sản xuất amylase. Đã có những thử nghiệm công nghệ như sản xuất amino 
acid từ nhộng tằm bằng protease, bột protein thịt bằng enzyme bromelain từ vỏ dứa . 
 Nghiên cứu enzyme còn có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng, đối với một số bệnh, đặc 
biệt là bệnh mang tính di truyền, có thể do thiếu hay mất hẳn một hoặc số enzyme trong các 
mô, các điều kiện không bình thường cũng có thể xuất hiện do hoạt tính dư thừa của một số 
enzyme đặc hiệu. Do đó xác định hoạt tính của một số enzyme trong huyết tương, hồng cầu 
hoặc trong các mô là rất quan trọng trong việc chẩn đoán bệnh. Enzyme đã trở thành các công 
cụ thực tếquan trọng không những trong y học mà cả trong công nghệ hóa học, trong chế biến 
thực phẩm Đối với nước ta nguồn enzyme từ thực vật có triển vọng lớn vì nguồn nghiên 
liệu rất phong phú (dứa, đu đủ, ). Trong quá trình chế biến dứa đóng hộp chỉ sử dụng một 
phần của quả dứa, phần còn lại là phụ phẩm. Nếu tận dụng được nguồn phế phẩm thì vừa có 
thể giảm thiểu chất hữu cơ gây ô nhiễm môi trường vừa có thể sản xuất sản phẩm enzyme 
bromelain có từ cây dứa. Enzyme bromelain có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase, 
esterase có thể phân hủy cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp, chúng có giá trị kinh tế cao.
 i MỤC LỤC
LỜI MỞ ĐẦU.............................................................................................................................i
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN......................................................................................................1
 1.1. Đặc điểm nguồn nguyên liệu:......................................................................................1
 1.2. Enzyme:.......................................................................................................................2
 1.2.1. Phân loại:..............................................................................................................2
 1.2.2 Tổng quan vê protease 2
 1.3. Enzyme Bromelain:.....................................................................................................3
 1.3.1. Cấu tạo hoá học:...................................................................................................3
 1.3.2. Cấu trúc không gian: ............................................................................................4
 1.3.3. Tính chất vật lí: ....................................................................................................4
 1.3.4. Hoạt tính của bromelain:......................................................................................5
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .......................................................................8
 2.1. Phương pháp nghiên cứu:............................................................................................8
 2.1.1. Nguyên liệu:.........................................................................................................8
 2.1.2. Hóa chất: ..............................................................................................................8
 2.1.3. Thiết bị: ................................................................................................................8
 2.1.4. Sơ đồ khối: ...........................................................................................................9
 2.1.5. Thuyết minh quy trình........................................................................................10
 2.2. Phương pháp thí nghiệm: ..........................................................................................10
 2.2.1. Khảo sát hoạt tính enzyme bromelain (Xác định hoạt tính enzym Bromelain 
 bằng phương pháp Anson cải tiến): .................................................................................10
 2.2.2. Định lương enzyme bằng phương pháp Biuret:.................................................12
 2.2.3. Phương pháp sắc kí lọc gel: ...............................................................................14
 2.2.4. Phương pháp điện di SDS- PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide):
 15
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN..............................................................................18
 ii 3.1. Thí nghiệm 1: tủa bromelain bằng cồn 96o. ..............................................................18
 3.2. Thí nghiệm 2: tinh sạch protein bằng phương pháp lọc gel. .....................................20
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN .......................................................................................................21
CHƯƠNG 5: TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................22
 iii DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Trái thơm...........................................................................................................1
Hình 2. Cấu trúc của Bromelain.....................................................................................4
Hình 3. Sơ đồ quy trình..................................................................................................9
Hình 4. Phản ứng Biuret...............................................................................................13
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. Những tính chất vật lý của bromelain thân.......................................................5
Bảng 2. Hoạt tính phân giải casein của bromelain.........................................................5
Bảng 3. Hoạt tính phân giải Benzoyl-L-Arginine amide (BAA) của bromelain. ..........6
Bảng 4. Các bước dựng đường chuẩn Tyrosin.............................................................11
Bảng 5. Các bước chuẩn bị mẫu enzym để đo hoạt tính..............................................11
Bảng 6. Lập đường chuẩn Biuret. ................................................................................14
Bảng 7. Chuẩn bị mẫu đo Biuret..................................................................................14
Bảng 8. Cách pha gel điện di. ......................................................................................16
Bảng 9. Khối lượng kết tủa thu được ở 3 tỉ lệ khác nhau. ...........................................18
Bảng 11. Hàm lượng Protein có trong mẫu trước và sau khi tủa bằng cồn 96o. .........18
Bảng 12. Hoạt tính enzyme có trong mẫu trước và sau khi tủa. ..................................18
 iv CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
 1.1. Đặc điểm nguồn nguyên liệu:
 Dứa là cây ăn quả nhiệt đới, có nguồn gốc ở Nam Mỹ 
(Brazil, Argentina, Paraguay), hiện ở những vùng này vẫn có thể 
tìm thấy nhiều giống dứa hoang dại.
 Hiện nay trên thế giới, cây dứa được trồng hầu hết ở các 
nước trừ ở Châu Âu. Các nơi trồng nhiều như là: Hawaii, Brazil, 
Philipines, Thailand Ở nước ta, dứa trồng từ Bắc đến Nam, diện 
tích trồng cả nước khoảng 40.000 ha với sản lượng khoảng 
500.000 tấn, trong đó 90% ở khu vực phía Nam. Các tỉnh trồng Hình 1. Trái thơm
dứa nhiều ở miền Nam là Kiên Giang, Tiền Giang, Cà Mau miền 
Bắc có Thanh Hóa, Tuyên Quang, Phú Thọ miền Trung có Nghệ An, Quảng Nam 
 Trên thế giới có khoảng 60-70 giống dứa và được chia thành 7 nhóm, trong đó có 3 
nhóm trồng phổ biến là nhóm Cayenne, nhóm Queen và nhóm Spanish.
 - Nhóm Cayenne là nhóm dứa trồng phổ biến nhất trên thế giới, chiếm khoảng 80% 
diện tích. Ở nước ta mới trồng ở một số ít nơi như Vĩnh Phúc, Nghệ An, Lâm Đồng. Dứa 
thuộc nhóm này có quả lớn nhất, mắt phẳng và nông. Thịt quả kém vàng, nhiều nước, ít ngọt 
và kém thơm hơn dứa Queen.
 - Nhóm Queen còn gọi là dứa Hoàng Hậu, dứa hoa, dứa tây. Đây là nhóm dứa trồng 
phổ biến nhất ở nước ta hiện nay, với các giống dứa tây, giống dứa Na Hoa ở phía Bắc, các 
giống Queen Long An, Kiên Giang ở các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long (còn gọi là khóm 
hoặc thơm). Dứa thuộc nhóm này có quả tương đối nhỏ, mắt lồi. Thịt quả vàng đậm, giòn, 
hương thơm, vị chua và ngọt lâu. Nhóm này có chất lượng cao nhất, trên thế giới thường 
dùng để ăn tươi.
 - Nhóm Spanish còn gọi là dứa Tây Ban Nha, dứa ta. Nhóm này được trồng ở 
Thailand, Cuba Quả dứa thuộc nhóm này lớn hơn dứa Queen, mắt sâu. Thịt quả vàng nhạt, 
có chỗ trắng, vị chua ít thơm nhưng nhiều nước hơn dứa hoa. Dứa nhóm này chịu bóng râm, 
ít dập nát khi vận chuyển và hàm lượng đường thấp nên không được phát triển.
 1 1.2. Enzyme:
 Trong cơ thể sống (các tế bào) luôn luôn xảy ra quá trình trao đổi chất. Sự trao đổi 
chất mà ngừng lại thì sự sống sẽ không còn tồn tại. Quá trình trao đổi của một chất là tập hợp 
của rất nhiều các phản ứng hóa học phức tạp. Enzyme là hợp chất protein xúc tác cho các 
phản ứng hóa học đó. Chúng có khả năng xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học nhất định và 
đảm bảo cho các phản ứng xảy ra theo một chiều hướng nhất định với tốc độ nhịp nhàng 
trong cơ thể sống. 
 ENZYME = XÚC TÁC SINH HỌC
 Chúng có khả năng xúc tác đặc biệt, thường là mạnh hơn nhiều so với các chất xúc tác 
tổng hợp. Tác dụng xúc tác của chúng mang tính đặc hiệu đối với cơchất, làm tăng đáng kể 
tốc độ các phản ứng hóa học xảy ra trong môi trường nước trong các điều kiện nhiệt độ và pH 
thích hợp
 Enzyme có trong hầu hết các loại tế bào của cơ thể sống. Chính do những tác nhân 
xúc tác có nguồn gốc sinh học nên enzyme còn được gọi là các chất xúc tác sinh học 
(biocatalysators) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học.
 Chúng là chất xúc tác sinh học không chỉ có vai trò quan trọng trong quá trình sinh 
trưởng, phát triển của mọi sinh vật mà nó còn giữ vai trò rất quan trọng trong các lĩnh vực 
khác như: công nghệ chế biến thực phẩm, trong kỹ thuật phân tích, trong công nghệ gen vào 
bảo vệ môi trường, đặc biệt là trong y học với ứng dụng sản xuất dược phẩm.
 Hiện nay người ta khai thác enzyme từ ba nguồn cơ bản: 
 - Nguồn động vật. 
 - Nguồn thực vật. 
 - Nguồn vi sinh vật.
 1.2.1. Phân loại:
 Ngày nay ngày càng nhiều enzyme mới được phát hiện, và để thống nhất tên gọi 
enzyme người ta đã phân tất cả enzyme làm 6 loại:
 - Oxidoreductase: là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hoá khử.
 - Transferase: là nhóm enzyme xúc tác phản ứng chuyển vị một nhóm (gốc) 
 nào đó từ chất này sang chất khác.
 2 - Hydrolase: là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân (phản ứng cắt 
 có sự tham gia của nước).
 - Lyase: là nhóm các enzyme xúc tác quá trình phân cắt một nhóm nào đó ra 
 khỏi hợp chất mà không có sự tham gia của nước.
 - Izomerase: là nhóm enzyme xúc tác sự đồng phân hoá, chuyển dạng đồng 
 phân này sang dạng đồng phân khác.
 - Ligase: là nhóm enzyme xúc tác sự tổng hợp chất hữu cơ nhờ năng lượng 
 ATP và các chất tương tự.
 1.2.2. Tổng quan về protease:
 Nhóm enzyme protease ( peptit – hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thủy phân liên kết 
peptit ( -CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptitde đến sản phẩm cuối cùng là axit amin. 
Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển axit amin.
 Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, 
cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật ( vi khuẩn, 
nấm, virus) đến thực vật ( đu đủ, dứa ) và động vật ( gan, dạ dày ). So với protease động 
vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi 
sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối 
lượng và hình dạng phân tử nên rất có thể tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. 
 Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có 
tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng Bromelain là protein-
enzyme có nhiều trong quả dứa và có một ít trong quả chuối, enzyme này được phát hiện từ 
giữa thế kỉ 19 nhưng mới được nghiên cứu từ giữa thế kỷ 20. Ở nước ta nghiên cứu về 
bromelain được bắt đầu từ những năm 1968 -1970
 1.3. Enzyme Bromelain:
 . Bromelain là nhóm protease thực vật có mã số EC-3.4.22.33 được thu nhận từ họ 
bromeliaceae, đặc biệt là từ thân và trái dứa. Ở mỗi bộ phận khác nhau thì bromelain có pH 
tối ưu khác nhau và cấu tạo cũng có sự khác nhau.
 Bromelain có trong toàn bộ cây dứa, nhưng nhiều nhất là trong quả. Bromelain là 
nhóm endoprotease có khả năng phân cắt các liên kết peptide nội phân tử protein để chuyển 
phân tử protein thành các đoạn nhỏ gọi là các peptide.
 3 Thành phần chủ yếu của bromelain có chứa nhóm sulfurhydryl thủy giải protein. Khi 
chiết tách và tinh sạch phân đoạn có chứa nhóm sulfurhydryl của bromelain thì thu được một 
enzyme thủy phân protein hiệu quả in vitro.
 1.3.1. Cấu tạo hoá học:
 Bromelain thân là một protease nhưng nó khác với các protease thực vật khác như 
papain, ficin ở chỗ nó là một glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3 manose, 2 
glucosamine, 1 xylose, và 1 fructose. 
 Các nghiên cứu ghi nhận, polypeptide của bromelain thân có acid amin đầu –NH 2 là 
valine và đầu carboxyl là glycine; còn đối với bromelain quả, acid amin đầu –NH2 là alanine.
 OH
 OH
 OH
 Fructose
 OH
 OH
 Maltose
 CH2OH
 OH CH2
 OH
 OH
 Glucofamine
 OH
 Maltose CH2OH
 Maltose
 CH2 OH
 OH NHCONH3 C
 NHCOCH CH
 OH 2
 OH N
 OH
 Xylose NHCONH3
 Hình 1.1: Cấu trúc sợi hydrate carbon của bromelain
 1.3.2. Cấu trúc không gian:
 Murachi và Busan phân tích cấu trúc bậc 1 của bromelain và nhận thấy cách sắp xếp 
amino acid trong phân tử bromelain như sau:
 - Ser – Val – Lys – Asn – Gln – Asn – Pro – Cys – Gly – Ala – Cys – Tryp -
 - Gly – Cys – Lys -
 Bromelain là một protease trongHình tâm2. Cấu hoạttrúc của động Bromelain. có chứa cysteine và hai sợi 
polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối - S – S -. Phân tử có dạng hình cầu do có cách sắp 
xếp phức tạp.
 4 Trong phân tử bromelain thân có chứa nhóm sulfurhydryl có vai trò chủ yếu trong 
hoạt tính xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite. Ngoài ra, trong phân tử 
còn có các ion Zn 2+ có lẽ có vai trò trong duy trì cấu trúc không gian của enzyme.
 1.3.3. Tính chất vật lí:
 Murachi và cộng sự năm 1964 đã nghiên cứu về tính chất vật lý của enzyme 
bromelain trích từ thân cây dứa và thấy như sau:
 Bảng 1. Những tính chất vật lý của bromelain thân.
 Tính chất Ký hiệu Số liệu
 Hằng số sa lắng S (s) 2.73
 Hằng số khuếch tán D (cm2 / s) 7.77 x 10 -7
 Thể tích riêng phần V (ml/g) 0.743
 Độ nhớt bên trong [ I ] (dl/g) 0.039
 Tỷ số ma sát f / fo 1.26
 Điểm đẳng điện pI 9.55
 Sự hấp thu A1%cm ở 280nm 20.1
 32.000 *
 Trọng lượng phân tử 32.100 **
 35.500 ***
 * : Tính bằng phương pháp sa lắng - khuếch tán
 ** : Tính từ hằng số sa lắng và độ nhớt bên trong
 *** : Tính bằng phương pháp Archibald 
 1.3.4. Hoạt tính của bromelain:
 1.3.4.1. Hoạt tính phân giải
 Bromelain có 3 hoạt tính: peptidase, amidase và esterase, hoạt tính esterase ở 
bromelain hơn papain trong đu đủ và ficin trong cây thuộc họ Sung.
 - Khả năng phân giải các cơ chất tự nhiên của bromelain.
 5 Bảng 2. Hoạt tính phân giải casein của bromelain.
 Cơ chất Hoạt tính phân giải casein ( UI/mg)
 Bromelain Bromelain Bromelain quả 
 thân quả xanh chín
 Casein 7.4 4.0 3.0
 - Đối với cơ chất là casein, hoạt tính phân giải của bromelain thân cao hơn trong 
 quả xanh và quả chín.
 - Khả năng phân giải các cơ chất nhân tạo của bromelain.
 Bảng 3. Hoạt tính phân giải Benzoyl-L-Arginine amide (BAA) của bromelain.
 Cơ chất Hoạt tính phân giải BAA ( UI/mg)
 Bromelain Bromelain Bromelian quả 
 thân quả xanh chín
 BAA 3.7 9.1 7.2
 Qua bảng trên ta thấy bromelain quả xanh có hoạt tính phân giải BAA cao hơn 
bromelain thân và quả chín.
 1.3.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính bromelain: 
 Giống như các loại chất sinh học khác, bromelain cũng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố 
như: cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại, một số nhóm 
chức, phương pháp ly trích, phương pháp tinh sạch, phương pháp tinh khiết...
 Các yếu tố như nhiệt độ, pH thích hợp cho hoạt động của các phản ứng xúc tác của 
bromelain không ổn định mà phụ thuộc lẫn nhau và phụ thuộc vào các yếu tố khác như: bản 
chất cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, sự có mặt của các chất hoạt hóa 
 ➢ Ảnh hưởng của pH: pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc 
 tác của enzyme, pH tối thích của bromelain không ổn định mà tuỳ thuộc vào 
 nhiệt độ, thời gian phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch 
 enzyme Ví dụ: Khi thu thập bromelain thân, nếu dùng tác nhân kết tủa là 
 (NH4)2SO4 thì enzyme có hoạt tính cao nhất ở pH = 4.8, ổn định ở pH = 4.6 - 
 5.4. Bromelain đã được tinh sạch một phần có hoạt tính cao nhất ở pH = 6.0 và 
 6